原硅酸通過BMP-2-Smad-RUNX2信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.探討原硅酸(orthosilicic acid)是否通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bonemorphogenetic protein2,BMP-2)的表達(dá)來促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細(xì)胞分化。
　　2.明確原硅酸是否通過BMP-2/Smad1/5/RUNX2信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)一型膠原(collagen type1,COL-

2、1)和骨鈣素。
　　方法:
　　分別向大鼠BMSCs中加入不同濃度（0、5、10、20、50μM）的原硅酸，作用48h后，Western blot法檢測(cè)BMP-2的表達(dá);向大鼠BMSCs中加入濃度為10μM的原硅酸，分別作用不同的時(shí)間(0、24、48、72 h)后，Western blot法檢測(cè)BMP-2的表達(dá);使用BMP-2拮抗劑noggin預(yù)先處理細(xì)胞2h，Western blot法檢測(cè)BMP-2的表達(dá);分別向大鼠BMS

3、Cs中加入不同濃度(0、5、10、20、50μM)的原硅酸，作用72 h后，Western blot法檢測(cè)COL-1的表達(dá);向大鼠BMSCs中加入濃度為10μM的原硅酸，分別作用不同的時(shí)間(0、48、72、96 h)后，Western blot法檢測(cè)COL-1的表達(dá);向大鼠BMSCs中加入不同濃度(0、5、10、20、50μM)的原硅酸作用7d后，以及使用noggin預(yù)先處理細(xì)胞2h后，均用微量酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)的活性;

4、向大鼠BMSCs中分別加入不同濃度（0、10μM）的原硅酸作用21d后，細(xì)胞茜素紅鈣染色法檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的生成量;分別向人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U2-OS細(xì)胞系中加入不同濃度(0、10、20、50μM)的原硅酸，作用72h后，Western blot法檢測(cè)COL-1、骨鈣素及BMP-2/Smad/RUNX2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。使用noggin預(yù)先處理細(xì)胞2h，Western blot法檢測(cè)BMP-2、P-Smad1/5和RUNX2的表

5、達(dá);在MG-63細(xì)胞系中加入不同濃度（0、10μM）原硅酸，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)BMP-2、P-Smad1/5和RUNX2。微量酶標(biāo)法檢測(cè)不同濃度(0、10、20、50μM)原硅酸對(duì)MG-63細(xì)胞內(nèi)ALP活性的影響。
　　結(jié)果:
　　BMSCs分別經(jīng)0、5、10、20、50μM原硅酸處理48h，5μM原硅酸開始使BMP-2表達(dá)增多，濃度為10μM時(shí)，BMP-2表達(dá)水平最高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但隨著

6、原硅酸濃度的增加，到50μM時(shí)，原硅酸對(duì)BMP-2的表達(dá)無明顯的促進(jìn)作用(P＞0.05);經(jīng)10μM原硅酸分別處理BMSCs24 h、48 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)BMP-2的表達(dá)較對(duì)照組均增加(P＜0.05)，其中48 h時(shí)，BMP-2的表達(dá)水平最高。處理72 h時(shí)，BMP-2表達(dá)水平下降并接近于對(duì)照組水平(P＞0.05);使用BMP-2的拮抗劑noggin(100ng/ml)預(yù)先處理BMSCs2 h后，可以顯著阻斷原硅酸對(duì)BMP-

7、2表達(dá)的上調(diào)作用;BMSCs分別經(jīng)0、5、10、20、50μM原硅酸處理72 h后，與對(duì)照組相比，COL-1的表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)，其中濃度為10μM時(shí)，COL-1的表達(dá)水平最高，濃度為50μM時(shí)，COL-1表達(dá)水平下降并接近于對(duì)照組水平(P＞0.05);經(jīng)10μM原硅酸分別處理BMSCs48 h、72 h、96 h后，與對(duì)照組相比，COL-1表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。其中處理72 h時(shí)，COL-1的表達(dá)水平較48 h、9

8、6 h時(shí)高;在原硅酸濃度分別為10和20μM條件下，ALP的活性相對(duì)于對(duì)照組是升高的(P＜0.05)，其中10μM時(shí)最高。50μM條件下，相對(duì)于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。預(yù)先使用noggin(100 ng/ml)處理BMSCs2 h，能夠顯著阻斷原硅酸對(duì)ALP活性的促進(jìn)作用;相對(duì)于對(duì)照組，應(yīng)用10μM原硅酸作用細(xì)胞21 d，能夠明顯增加細(xì)胞中鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量;10μM原硅酸作用于MG-63和U2-OS細(xì)胞系72h，能顯著促進(jìn)

9、BMP-2、P-Smad1/5、RUNX2、COL-1和骨鈣素的表達(dá)。在此條件下，ALP的活性也顯著增加，并且細(xì)胞免疫熒光陽性率較對(duì)照組明顯升高;Noggin能夠阻斷原硅酸對(duì)P-Smad1/5、RUNX2、COL-1表達(dá)的上調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　1.原硅酸能夠促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并且BMP-2的表達(dá)上調(diào)可能是這一過程中的重要作用機(jī)制之一。
　　2.原硅酸通過BMP-2/Smad1/5/RUNX2