P物質對子宮內膜腺癌生物學行為的影響及機制研究.pdf

1、子宮內膜癌是發(fā)生在子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內膜腺體的腺癌最常見，2011年全球癌癥統(tǒng)計數據表明子宮內膜癌已成為全球范圍內最常見的婦科惡性腫瘤，并且隨著人口老齡化、肥胖及激素替代療法的應用，其發(fā)病率及死亡率的增加趨勢更加顯著，但其病因學機制尚未完全闡明。隨著分子生物學和免疫學的發(fā)展，源自腫瘤組織的肽類物質的表達及分泌日益引起人們的關注，P物質(Substance P, SP)因其廣泛分布于人體各個組織而成為研究的熱點。

2、>　　SP是由11個氨基酸殘基組成的神經多肽，由Tac-1基因編碼，屬速激肽家族，其最初是作為神經遞質及疼痛遞質而被人們熟悉，具有多種生物學活性：參與疼痛的傳遞，引起胃腸道平滑肌收縮，調節(jié)炎癥和免疫反應；在中樞神經系統(tǒng)中作為神經遞質或調節(jié)遞質，調節(jié)情感和行為，阻斷其受體后可起到止痛、止吐、抗抑郁和抗焦慮的作用。近年來，一些研究結果顯示SP在腫瘤的發(fā)展過程中也起到調節(jié)作用，其在多種腫瘤組織中高表達，能夠增加腫瘤組織中神經纖維的數量，增強腫

3、瘤組織中的信號傳遞，有助于腫瘤的生長及轉移；其可引起腫瘤細胞有絲分裂增加、使腫瘤細胞免于凋亡以及調節(jié)腫瘤細胞的遷移(包括侵襲、浸潤及轉移)；其還在腫瘤內血管內皮細胞及癌灶旁血管內皮細胞表達，可刺激腫瘤血管生成，通過增加對腫瘤組織的血供來促進腫瘤增長及轉移。
　　SP受體包括神經激肽1(neurokinin1, NK-1)、神經激肽2(neurokinin2, NK-2)及神經激肽3(neurokinin3, NK-3)，但SP主要

4、與 NK-1結合而發(fā)揮生物學作用。NK-1屬G蛋白偶聯(lián)受體，其與SP結合后可引起磷酸肌醇水解、鈣離子內流及絲裂原激活蛋白激酶被激活，從而促使腫瘤細胞增殖、分化、血管形成及轉移；國內外報道中提出高選擇性NK-1受體拮抗劑L-733,060可以明顯抑制腫瘤細胞的生長，促進癌細胞的凋亡，而這些功能主要是依靠抑制SP而發(fā)揮作用。但是目前對于SP在子宮內膜腺癌組織中的表達特點及其與臨床病理特征的關系尚不清楚，SP以及 NK-1受體拮抗劑對子宮內膜

5、腺癌細胞增殖和侵襲的影響也尚無報道。
　　因此，本研究通過免疫組織化學染色法、Real-Time PCR、Western-blot方法觀察SP在子宮內膜腺癌組織中的表達情況并分析其與臨床病理特征的關系，采用MTT、Transwell、Real-Time PCR、Western-blot、ELISA技術研究SP及NK-1受體拮抗劑對子宮內膜腺癌Ishikawa細胞增殖、侵襲以及VEGF-C、MMP-9表達的影響，以闡明P物質在子宮內

6、膜腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。
　　第一部分 P物質在子宮內膜腺癌中的表達及意義
　　目的：探討P物質在子宮內膜腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系。
　　方法：選取2014.1-2014.3在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院術前未經任何治療的子宮內膜腺癌患者15例及同期行子宮全切術且病理證實無子宮內膜病變者10例作為研究對象，采用Real-Time PCR及Western-blot方法比較 SP在正常子宮內膜及子宮內膜腺癌組

7、織中表達的差異。選取2014.4-2014.12在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院住院手術治療的子宮內膜腺癌患者56例為實驗組，其中FIGOⅠ期28例，Ⅱ期7例，Ⅲ期21例；組織學分級按照WHO標準：高分化(G1)17例，中分化(G2)21例，低分化(G3)18例；浸潤肌層<1/234例，≥1/222例；淋巴結轉移39例，無轉移17例；取同期19例行子宮全切術且病理證實無子宮內膜病變者為對照組，采用免疫組織化學染色檢測SP的表達，分析SP表達與子宮

8、內膜腺癌臨床病理特征的關系。
　　結果：
　　1 Real-Time PCR結果顯示SPmRNA在子宮內膜腺癌組織及正常組織中的相對表達量分別為2.624±0.134、1.015±0.021，兩組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.001)；Western-blot結果顯示SP蛋白在子宮內膜腺癌組織的相對表達量為1.062±0.094，明顯高于正常組織中的0.820±0.060(P<0.05)；
　　2 SP表達于子宮內膜腺癌細

9、胞的胞質及部分胞膜，56例組織標本中陽性表達率為67.86％；其在正常子宮內膜細胞中甚少表達，偶表達于細胞的胞質，陽性表達率為21.05%，兩組比較有統(tǒng)計學差異( P<0.001)；
　　3 SP在子宮內膜腺癌不同的組織學分級(G1、G2及G3)中陽性表達率分別為52.94%、71.73%及77.77%，三組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；在肌層浸潤深度<1/2及≥1/2組中 SP陽性表達率分別為64.51%和72.72%，

10、兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SP在Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ-Ⅳ期子宮內膜腺癌患者中陽性表達率分別為53.57%、71.43%及85.71%，三組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但組間比較僅Ⅰ期與Ⅲ-Ⅳ期患者有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；在淋巴結轉移及無淋巴結轉移組SP表達陽性率分別為47.06%和76.92%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：P物質在子宮內膜腺癌組織中高表達，并且與淋巴結轉移有關，說明神經內分泌機制參

11、與了子宮內膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，為子宮內膜癌發(fā)病機制的研究提供了新的理論依據，而P物質也有望成為子宮內膜腺癌判斷預后及隨訪的新指標。
　　第二部分 P物質對子宮內膜腺癌Ishikawa細胞增殖和侵襲的影響
　　目的：探討 P物質對子宮內膜腺癌 Ishikawa細胞增殖和侵襲的影響及作用機制。
　　方法：利用Real-Time PCR及Western-blot的方法檢測Ishikawa細胞株中SP及其受體NK-1的表達

12、；向Ishikawa培養(yǎng)液中加入不同濃度的SP，采用MTT法檢測SP促細胞增殖的作用，利用Transwell小室檢測其對細胞侵襲能力的影響；向 Ishikawa細胞培養(yǎng)液中加入 NK-1受體拮抗劑L-733,060，再與SP共培養(yǎng)，觀察SP促細胞增殖及侵襲作用的變化。
　　結果：
　　1子宮內膜腺癌Ishikawa細胞及正常組織中SPmRNA的相對表達量分別為3.645±0.275和1.020±0.025；NK-1mRNA的

13、相對表達量分別為4.238±0.474和1.030±0.042。子宮內膜腺癌 Ishikawa細胞中 SP及 NK-1的表達均明顯高于正常組織(P<0.001)；
　　2子宮內膜腺癌Ishikawa細胞及正常組織中SP蛋白的相對表達量分別為1.198±0.110和0.869±0.067；NK-1蛋白的相對表達量分別為1.251±0.116和0.919±0.040。子宮內膜腺癌 Ishikawa細胞中 SP及 NK-1的表達均明顯高

14、于正常組織(P<0.01)；
　　3向Ishikawa細胞中加入SP培養(yǎng)48小時后，與空白對照組相比， SP有明顯的促細胞增殖作用( P<0.001)；當SP在10-9mol/L~10-7mol/L時，隨著SP濃度的增加，細胞增殖能力逐漸增強( P<0.05)；但當SP增加到10-6 mol/L時，細胞增殖能力有所下降。將不同濃度 NK-1受體阻滯劑L-733,060(0,5,10,20 and40μmol/L)與Ishikawa

15、細胞預培養(yǎng)后再加入10-7mol/LSP培養(yǎng)48h后，與空白對照組相比，5μmol/L組無明顯抑增殖作用(P>0.05)，其他各組細胞增殖率均隨L-733,060的濃度增加逐漸降低( P<0.05)，而20μmol/L與40μmol/L組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4在侵襲實驗中實驗組SP濃度選取10-9mol/L~10-7mol/L，與Ishikawa細胞共培養(yǎng)48小時后，各實驗組腫瘤細胞穿過基底膠的數量明顯高于

16、空白對照組(P<0.01)；選取SP濃度為10-7mol/L及L-733,060濃度20μmol/L進行 Transwell小室實驗，結果顯示 Ishikawa細胞侵襲能力明顯低于10-7mol/L SP組(P<0.01)。
　　結論：P物質可明顯促進子宮內膜腺癌細胞的增殖及侵襲，并且NK-1受體拮抗劑可明顯抑制其這一能力，說明P物質對子宮內膜腺癌的促增長作用主要是通過與NK-1受體結合而產生的，為子宮內膜腺癌的治療提供了新的靶點

17、。
　　第三部分 P物質對Ishikawa細胞VEGF-C和MMP-9表達的影響
　　目的：檢測 P物質及其受體拮抗劑對子宮內膜腺癌 Ishikawa細胞血管內皮生長因子C(Vascular endothelial growth factor C, VEGF-C)及基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP-9)表達的影響，探討P物質促進子宮內膜腺癌侵襲及轉移的機制。
　　方法：向I

18、shikawa培養(yǎng)液中加入不同濃度的SP，利用Real-Time PCR及Western-blot的方法檢測Ishikawa細胞中VEGF-C及MMP-9表達的變化；采用ELISA法檢測不同組別細胞培養(yǎng)上清中VEGF-C及MMP-9的含量。向Ishikawa細胞培養(yǎng)液中加入NK-1受體阻滯劑L-733,060，再與SP共培養(yǎng)，利用Real-Time及Western-blot檢測VEGF-C及MMP-9的表達；采用ELISA法檢測不同組別

19、細胞培養(yǎng)上清中VEGF-C及MMP-9的含量。
　　結果：
　　1不同濃度SP(10-9mol/L、10-8mol/L及10-7mol/L)作用于Ishikawa細胞48h后，VEGF-CmRNA的相對表達量分別為2.133±0.133、2.533±0.191、2.9455±0.287；MMP-9 mRNA的相對表達量分別為2.035±0.160、2.450±0.205、3.045±0.258，兩者均明顯高于空白對照的1.0

20、50±0.053和1.020±0.028(P＜0.001)。10-7mol/L SP+20μmol/L L-733,060組VEGF-CmRNA及 MMP-9 mRNA的相對表達量分別為1.465±0.108和1.483±0.184，均明顯低于10-7mol/L SP組(P＜0.001)。
　　2空白對照、10-9mol/L SP、10-8mol/L SP及10-7mol/L SP組VEGF-C蛋白的相對表達量分別為0.953±0

21、.03、1.130±0.365、1.235±0.420、1.343±0.512； MMP-9蛋白的相對表達量分別為0.913±0.038、1.228±0.046、1.350±0.063、1.553±0.120，各實驗組VEGF-C和MMP-9的表達均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)；10-7mol/L SP+20μmol/L L-733,060組 VEGF-C及 MMP-9蛋白相對表達量分別為0.840±0.036和0

22、.855±0.029，均明顯低于10-7mol/L SP組(P＜0.01)。
　　3空白對照和各實驗組(10-9mol/L、10-8mol/L及10-7mol/L)培養(yǎng)上清液中 VEGF-C的含量分別為847.813±28.311、1144.897±38.955、1555.823±56.472、2151.397±79.277；MMP-9含量分別為84.683±5.073、125.327±13.701、177.087±23.033、

23、250.567±31.480，各實驗組VEGF-C和MMP-9的含量均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)；10-7mol/L SP+20μmol/L L-733,060組 VEGF-C及 MMP-9含量分別為955.933±31.062及96.663±7.02，均明顯低于10-7mol/L SP組(P＜0.01)。
　　結論：P物質可上調子宮內膜腺癌細胞中VEGF-C和MMP-9的表達，而 NK-1受體拮抗劑可抑制