X射線對子宮內(nèi)膜及卵巢生殖功能影響的分子機制的研究.pdf

1、目的:
　　X射線在人類生活中無處不在，既有來自于外太空的自然本底輻射，同時，在醫(yī)療領域中，X射線被廣泛應用于疾病的診斷及治療。X射線能夠穿透包括人體組織在內(nèi)的多種物質(zhì)，造成組織發(fā)生病理性損傷，造成這種損傷的主要機制是由于電離輻射通過在細胞中產(chǎn)生大量自由基而造成的。隨著科學技術的發(fā)展，電離輻射在各個領域的應用愈加廣泛，輻射帶來的危害越來越受到人們的關注，特別是X射線對生殖系統(tǒng)的影響。因此，探索X射線影響女性生殖能力的機制及尋找更為

2、有效的輻射保護劑顯得尤為重要。
　　胚胎著床是一個極為復雜的生物學過程，不但需要子宮內(nèi)膜具有良好的接受態(tài)，也需要卵巢具有正常的排卵功能及規(guī)律的激素分泌，其中，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)功能失調(diào)都會導致不孕癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢中過量的ROS(ReactiveOxygen Species)聚集會導致卵巢顆粒細胞發(fā)生凋亡，影響正常排卵及激素分泌。當子宮組織自身抗氧化能力下降時，其生長會受到抑制。已有報道表明:線粒體與溶酶體在細胞衰老的過程中發(fā)

3、揮重要作用。目前，關于X射線通過氧化性損傷影響女性生殖系統(tǒng)功能是否與線粒體及溶酶體功能損傷相關尚未見報道。
　　自噬是廣泛存在于真核細胞中的生理現(xiàn)象，正常情況下，細胞內(nèi)的自噬水平較低，當受到外界刺激時，自噬水平會增加，利用溶酶體的吞噬作用降解細胞內(nèi)的毒物，利于細胞的存活。然而，當自噬水平過高時，會造成細胞的死亡。研究表明，ROS在細胞的自噬過程具有調(diào)控作用。然而，自噬在X射線影響子宮內(nèi)膜接受態(tài)的過程中發(fā)揮何種作用及相關信號通路尚需

4、要進一步研究。
　　N-乙酰半胱氨酸(N-acetycysteine，NAC)，是一種含有活性巰基(-SH)的分子，可抑制或減少不同原因造成的組織氧化性損傷。NAC作為細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的前體分子，是一種常用的抗氧化劑。已有一些研究表明，NAC作為一種粘痰溶解藥物在臨床上被廣泛應用已有四十多年的歷史。然而NAC是否能應用于電離輻射暴露引起的女性生殖系統(tǒng)損傷的保護仍未見報道。
　　本文通過體內(nèi)與體外實驗，分別探討X射線對人子

5、宮內(nèi)膜細胞的氧化性損傷機制，X射線引起人子宮內(nèi)膜細胞中發(fā)生自噬的途徑，自噬在子宮內(nèi)膜接受態(tài)損傷過程中發(fā)揮的作用，及NAC對X射線誘導小鼠卵巢發(fā)生功能衰竭過程中的保護作用和機制。本文的研究有助于探討電離輻射影響女性生殖健康的分子機制，并為NAC在電離輻射造成女性不孕癥的治療中提供新的實驗依據(jù)。
　　方法:
　?。ㄒ唬射線通過影響溶酶體及線粒體功能導致人子宮內(nèi)膜細胞內(nèi)DNA氧化性損傷影響其功能
　　1.RL95-2細胞進

6、行2 Gy的X線照射及NAC，NH4C1和抑胃肽A(PepstatinA，PepA)預處理;
　　2.CCK-8檢測人子宮內(nèi)膜上皮細胞(RL95-2)存活率;
　　3.利用透射電鏡及掃描電鏡觀察RL95-2細胞內(nèi)外部形態(tài)變化;
　　4.利用體外胚胎粘附模型檢測RL95-2細胞對人滋養(yǎng)層細胞(JAR)的接受性;
　　5.利用羅丹明123熒光染色法進行RL95-2細胞線粒體膜電位的檢測;利用Westernblot檢測

7、細胞質(zhì)中細胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）從線粒體中釋放的情況;
　　6.利用Lyso-tracker red熒光染色法進行RL95-2細胞溶酶體膜穩(wěn)定性的檢測;利用Western blot檢測細胞質(zhì)中組織蛋白酶D(CathepsinD，CD)從溶酶體中釋放的情況;
　　7.利用DCFH-DA熒光染色法進行RL95-2細胞細胞內(nèi)ROS生成的檢測;利用免疫熒光檢測細胞中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)形成;

8、r>　　8.利用彗星實驗，免疫熒光及激光共聚焦和Western blot分別檢測RL95-2細胞DNA斷裂和磷酸化組蛋白(γH2AX)的表達水平。
　　（二）X射線通過生成ROS引起人子宮內(nèi)膜上皮RL95-2和HEC細胞自噬的途徑和意義
　　1.細胞進行2 Gy和10 GyX射線照射及NAC，3-MA預處理;
　　2.Western blot檢測凋亡及增殖相關蛋白的表達;利用流式細胞術檢測細胞凋亡的情況;
　　3

9、.掃描電鏡觀察細胞內(nèi)自噬小體的形成;Western blot檢測自噬相關蛋白的表達;Lyso tracker red及MDC熒光染色法檢測細胞內(nèi)自噬水平;
　　4.DCFH-DA熒光染色法檢測細胞內(nèi)ROS的形成;
　　5.Western blot檢測MAPKs信號通路的激活;
　　6.抑制自噬后利用體外胚胎粘附模型檢測RL95-2細胞對人滋養(yǎng)層細胞(JAR)的接受性;利用集落形成實驗繪制細胞存活曲線。
　　（三）

10、NAC對X射線導致小鼠卵巢功能衰竭中的保護作用
　　1.小鼠進行NAC預處理及3 GyX射線全身照射;
　　2.ELISA分析照射后小鼠血清中雌激素，孕激素，抗穆氏管荷爾蒙及促卵泡生成素的表達水平;
　　3.小鼠卵巢稱重檢測卵巢重量變化;
　　4.HE染色觀察卵巢中各級卵泡形態(tài)的變化;
　　5.Western blot及免疫組化檢測卵巢組織中PCNA的表達水平;
　　6.免疫組化檢測卵巢組織中Cyt

11、C和caspase-3的表達水平;TUNEL實驗檢測卵巢組織中凋亡的水平;
　　7.利用總谷胱甘肽檢測試劑盒檢測卵巢組織中GSH水平;利用免疫組化檢測8-OHdG的表達;
　　8.掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜吞飲泡的形成;H&E染色觀察子宮內(nèi)膜上皮形態(tài)學變化;雄雌鼠交配后，統(tǒng)計交配率，受精率及胚胎粘附率。
　　結(jié)果:
　　（一）X射線通過影響溶酶體及線粒體功能導致人子宮內(nèi)膜細胞內(nèi)DNA氧化性損傷影響其功能
　　1.

12、X射線降低RL95-2細胞存活率，細胞呈衰老趨勢，細胞表面微絨毛增加;RL95-2細胞與JAR細胞間的粘附率下降;
　　2.X射線降低線粒體膜電位及溶酶體膜穩(wěn)定性;
　　3.X射線誘導細胞內(nèi)發(fā)生氧化應激及DNA的氧化性損傷;
　　4.X射線誘導細胞內(nèi)DNA發(fā)生雙鏈斷裂;
　　5.細胞經(jīng)過NAC，NH4C1及PepA預處理后，能夠不同程度的保護溶酶體與線粒體功能，降低氧化應激水平及DNA損傷，并且促進JAR與RL9

13、5-2細胞的粘附。
　?。ǘ射線通過生成ROS引起人子宮內(nèi)膜上皮RL95-2和HEC細胞自噬的途徑和意義
　　1.X射線促進細胞凋亡;
　　2.X射線造成細胞內(nèi)發(fā)生自噬;
　　3.NAC預處理后經(jīng)X射線照射，細胞內(nèi)的自噬水平顯著降低;
　　4.X射線通過激活JNK信號通路引起自噬，NAC預處理抑制JNK信號通路;
　　5.抑制自噬會增加細胞內(nèi)的凋亡水平，減少RL95-2和HEC細胞與JAR細胞間的

14、粘附，增加細胞對射線的敏感性。
　?。ㄈ㎞AC對X射線導致小鼠卵巢功能衰竭中的保護作用
　　1.X射線導致小鼠卵巢重量減輕;
　　2.X射線減少小鼠血清中雌激素，孕激素及抗穆氏管荷爾蒙的表達，增加促卵泡生成素的表達;
　　3.X射線顯著減少卵巢中原始卵泡，初級卵泡的形成，對腔前卵泡影響不顯著，會增加閉鎖卵泡的形成;
　　4.X射線影響子宮內(nèi)膜形態(tài)，產(chǎn)生不規(guī)則形態(tài);顯著抑制子宮內(nèi)膜上皮中吞飲泡的形成;顯著影

15、響雌鼠生育能力;
　　5.X射線抑制卵巢顆粒細胞增殖，促進凋亡;
　　6.X射線誘導卵巢細胞中發(fā)生氧化應激;
　　7.NAC預處理顯著恢復卵巢的卵泡形成，激素分泌，減少氧化應激水平，抑制凋亡，促進增殖，改善子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能，在一定程度上恢復胚胎粘附。
　　結(jié)論:
　　（一）X射線通過影響溶酶體及線粒體功能導致人子宮內(nèi)膜細胞內(nèi)DNA氧化性損傷影響其功能
　　1.X射線造成溶酶體及線粒體功能下降;

16、>　　2.溶酶體線粒體功能的下降導致氧化性DNA損傷;
　　3.線粒體-溶酶體軸在氧化損傷中發(fā)揮作用;
　　4.抗氧化劑NAC及溶酶體保護劑NH4C1和PepA對X射線造成的RL95-2細胞損傷均有保護意義并且改善細胞功能。
　　（二）X射線通過生成ROS引起人子宮內(nèi)膜上皮RL95-2和HEC細胞自噬的途徑和意義
　　1.X射線通過增加細胞內(nèi)ROS引起自噬;
　　2.ROS通過激活JNK信號通路引起自噬;<