骨髓間充質干細胞對舌鱗癌生物學行為影響的研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過平板克隆實驗、CCK8細胞增殖實驗、Transwell遷移實驗和Transwell侵襲實驗等體外實驗探討(BMSCs)對舌鱗癌(TSCC)細胞系生物學行為的影響，同時，建立TSCC裸鼠皮下移植瘤動物模型，尾靜脈注射攜帶綠色熒光蛋白標記的BMSCs，通過測量腫瘤體積、熒光顯微鏡觀察、組織學觀察以及免疫組化染色等方法探討B(tài)MSCs在體內向TSCC移植瘤模型組織的遷移及對移植瘤模型生物學行為的影響。
　　方法

2、：
　　1、BMSCs對舌鱗癌細胞系CAL27生物學行為的影響
　　1.1 舌鱗癌細胞系CAL27和BMSCs的共培養(yǎng)
　　培養(yǎng)舌鱗癌細胞系CAL27和BMSCs至對數(shù)生長期，舌癌細胞用1640完全培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，使細胞密度達到2.5×105個，加入至6孔板中。BMSCs用BMSCs培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，使細胞密度達到1.5×105個，加入到Transwell系統(tǒng)的上室中。
　　1.2 平板克隆實驗
　　實驗

3、分為兩組:共培養(yǎng)組和對照組。共培養(yǎng)組中，舌鱗癌細胞共培養(yǎng)24h后，以每皿1×104個舌鱗癌細胞密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，每2天補加100ul共培養(yǎng)的上清液，對照組加等量的單獨培養(yǎng)的舌癌細胞和舌癌細胞上清液。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，多聚甲醛固定，結晶紫染色，直接計數(shù)克隆，比較克隆形成的大小和數(shù)目。
　　1.3 CCK8增殖實驗
　　實驗分為兩組:共培養(yǎng)組和對照組。共培養(yǎng)組中:舌鱗癌細胞共培養(yǎng)24h后，以每孔10

4、00個細胞種到96孔板中，每隔24h加20ul共培養(yǎng)的上清液;對照組加等量的單獨培養(yǎng)的舌癌細胞和舌癌細胞上清液，每隔24h檢測一次細胞活力，檢測前每孔加10ul CCK8試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5h，使用酶標儀用450nm激發(fā)光檢測OD值，繪制增殖曲線。
　　1.4 Transwe11遷移實驗
　　實驗組中將共培養(yǎng)24h的舌癌細胞1×104個加入小室中，下室中加入10％ FBS培養(yǎng)液。對照組中上室加入等量的單獨培養(yǎng)的舌癌

5、細胞，下室中加入10％ FBS培養(yǎng)液。兩組上室均使用無血清培養(yǎng)液，其他培養(yǎng)條件一致，24h后多聚甲醛固定，結晶紫染色，切下基底膜置于載玻片上觀察，隨機選取5個清晰的視野，拍照，計數(shù)。
　　1.5 Transwell侵襲實驗
　　將transwell小室至于24孔板中，加入稀釋后的Matrigel基質膠，水化基底膜，將共培養(yǎng)24h的細胞消化，使用無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液，每個小室中加入100ul，使細胞個數(shù)為1×104個。下室

6、中加入600ul的10％FBS培養(yǎng)液;對照組中上室加入等量的單獨培養(yǎng)的舌癌細胞，下室中加入10％FBS培養(yǎng)液，保持兩組間的培養(yǎng)條件一致，多聚甲醛固定，結晶紫染色，切下基底膜置于載玻片上觀察，隨機選取5個清晰的視野，拍照，計數(shù)。
　　2、BMSCs對舌鱗癌移植瘤生物學行為的影響的體內研究
　　2.1 舌鱗癌移植瘤模型的建立
　　本實驗采用貼壁法培養(yǎng)人舌鱗癌細胞，當體外擴增的細胞量達到移植標準時，將細胞消化移入離心管，10

7、00rpm離心5min，棄上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)基制成細胞懸液，并調節(jié)細胞密度至1×107個/mL。5周齡健康雄性BALB/c裸小鼠，18只，適應1周后，隨機取其中12只裸小鼠，以密度1×107個舌鱗痛細胞(注射劑量為0.2 mL)注射于每只裸鼠近左腋部皮下，每天用游標卡尺分別測量裸鼠腫瘤的長徑(a)及短徑(b)，長度單位為mm，腫瘤體積計算公式為V=1/2ab2，當平均組內瘤體積達到50mm3時，為達到成瘤標準。
　　2.

8、2 BMSCs向舌鱗癌移植瘤的遷移
　　培養(yǎng)BMSCs，當細胞融合度達到80％-90％時，給細胞傳代，利用攜帶GFP基因的慢病毒載體感染BMSCs，并于體外擴增，數(shù)量級達到移植要求。于腫瘤達到成瘤標準后，取生長旺盛的GFP標記的BMSC細胞，調節(jié)細胞密度為5×106個/mL，用1mL注射器緩慢注入TSCC+BMSC組和BMSC組小鼠尾靜脈，每只小鼠注射0.2mL。4周后處死裸鼠，解剖出腫瘤分兩份，一份置于液氮中保存，另一份用福爾馬

9、林溶液固定，做石蠟切片。
　　從液氮中取出冷凍的移植瘤組織進行組織切片，于熒光顯微鏡下檢測GFP的表達。用Abcam公司的兔單克隆抗體GFP抗體作為一抗，按試劑盒說明書的方法對組織進行免疫組化檢測GFP的表達情況。
　　2.3 BMsCs對舌鱗癌移植瘤生長的影響
　　觀察尾靜脈注射BMSCs后裸鼠腫瘤生長情況和體重變化情況，每兩天測量一次裸鼠腫瘤體積及裸鼠體重，按照文獻上報道的方法（V=1/2ab2，V為腫瘤體積，a為

10、長徑，b為短徑）計算腫瘤體積大小并進行統(tǒng)計學分析。并對各組腫瘤組織的分化類型進行統(tǒng)計學分析。
　　體內免疫組化實驗按試劑盒說明書對TSCC組、TSCC+BMSC組舌癌組織中與細胞增殖密切相關的指標Ki67，c-myc和PCNA的表達進行檢測。先進行二甲苯脫蠟和水化，然后參照一抗說明書進行抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，滴加適量一抗、適量辣根酶標羊抗兔IgG聚合物和適量DAB顯色劑，蘇木精復染后沖洗，脫水，透明，封片。用PBS代替一

11、抗作為陰性對照，無特異性染色者為陰性，細胞或組織呈特異性棕黃色染色者為陽性。對免疫組化實驗結果進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1、BMSCs對舌鱗癌細胞系CAL27生物學行為的影響的體外研究
　　1.1 平板克隆實驗:
　　培養(yǎng)兩周后，共培養(yǎng)組的細胞克隆數(shù)目多于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033＜0.05)，說明CAL27舌癌細胞與BMSCs共培養(yǎng)后增殖能力增加。
　　1.2 CCK8增殖實驗:<

12、br>　　實驗結果顯示:共培養(yǎng)組和對照組在0h（P=0.729＞0.05）和24h(P=0.890＞0.05)差異無統(tǒng)計學意義;在48h（P=0.025＜0.05）和72h（P=0.004＜0.05），共培養(yǎng)組增殖高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　1.3 Transwell遷移實驗:共培養(yǎng)組細胞遷移到小室下表面的數(shù)量多于對照組，兩組間差異顯著（P=0.001＜0.05），說明共培養(yǎng)后，癌細胞的遷移能力變強。
　　1.4 T

13、ranswell侵襲實驗:在侵襲實驗中，共培養(yǎng)組舌鱗癌細胞將基質膠分解后運動到小室下表面細胞多于對照組，且差異顯著（P=0.002＜0.05），說明共培養(yǎng)后，癌細胞的侵襲能力變強。
　　2、BMSCs對舌鱗癌移植瘤生物學行為影響的體內研究
　　2.1 舌鱗癌移植瘤動物模型的建立
　　培養(yǎng)的舌鱗癌細胞高倍鏡下核異常分裂象多見，說明舌癌細胞增殖非?；钴S。于裸鼠近左腋部處皮下注射舌鱗癌細胞系CAL27后，1周后在左腋部皮下可

14、見膨隆，2周后可觸及質硬的結節(jié)性腫塊，后腫瘤逐漸增大，裸鼠移植瘤的大小與生長時間成正比，隨時間增長而增大。3周達到成瘤標準，成功建立裸鼠舌癌移植瘤動物模型。
　　2.2 靜脈注射的BMSCs向舌鱗癌移植瘤的遷移
　　培養(yǎng)的BMSCs為均質的、細長的、典型的成纖維細胞形態(tài)，呈漩渦狀生長。攜帶GFP慢病毒感染BMSCs后可觀察到綠色熒光表達，GFP隨細胞傳代穩(wěn)定表達。將BMSCs緩緩注入裸鼠尾靜脈。4周后，處死裸鼠。解剖學發(fā)現(xiàn)，

15、腫瘤包膜完整，表面光滑，與周圍組織分界清楚，與背部皮膚、肌肉組織無明顯粘連，形狀多不規(guī)則，表面結節(jié)狀，腋下及腹股溝淋巴結未見明顯腫大。
　　在熒光顯微鏡下觀察，在TSCC+BMSC組腫瘤組織中可見綠色熒光，而在TSCC組腫瘤組織中未見綠色熒光。免疫組織化學實驗發(fā)現(xiàn)，在TSCC+BMSC組，GFP抗體定位于腫瘤組織和肝臟組織中，未在肺臟組織中發(fā)現(xiàn)。而在未注射BMSC的TSCC組，在腫瘤組織、肝臟和肺組織中均未見GFP。說明BMSCs

16、可遷移至舌癌組織中。
　　2.3 BMSCs對舌鱗癌移植瘤生長的影響
　　注入BMSCs4周后我們發(fā)現(xiàn):BMSC組裸鼠體重增加明顯，TSCC組次之，BMSC+TSCC組裸鼠體重增加不明顯，BMSC+TSCC組和TSCC組裸鼠體重增加無顯著差異（P＞0.05）。移植BMSCs后的前15天，腫瘤大小無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），從第16天開始，BMSC+TSCC組腫瘤增長較快，較TSCC組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明B

17、MSCs促進舌癌生長。免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)Ki67，c-myc和PCNA表達在TSCC細胞核中，統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，TSCC+BMSCs組表達較TSCC組強（P＜0.05）。說明BMSCs促進舌癌細胞的增殖。
　　結論:
　　1、成功建立舌鱗癌動物模型。
　　在CAL27舌鱗癌細胞接種量、接種部位、動物周齡及狀態(tài)等內外部條件適宜情況下，成瘤率可達100％。
　　2、BMSCs能促進舌癌細胞遷移并且能遷移至舌癌組織中。