半側(cè)顏面發(fā)育不全患者骨髓間充質(zhì)干細胞生物學行為及免疫調(diào)控能力的研究.pdf

1、半側(cè)顏面發(fā)育不全疾病(Hemifacial Microsomia,HFM),是繼唇腭裂后,臨床上較常見的一類頜面部發(fā)育畸形疾病。由于該病畸形主要涉及頜面部,對患者的日常生活和心理健康都造成了嚴重影響。
　　對該疾病的診斷和治療一直都是影像學、正畸學和頜面外科學關(guān)注的要點。但由于該病臨床表型復雜且病因不明,在診斷中除了詳細的家族史、既往史采集外還需詳細的檢查。近幾年,隨著現(xiàn)代口腔醫(yī)學的快速發(fā)展和正畸正頜聯(lián)合治療的推廣,對HFM患者的

2、治療已經(jīng)逐漸完善化和系統(tǒng)化。
　　對于該病致病原因一直也是討論的熱點,目前尚無結(jié)論,但大多的研究都認為HFM可能為多種病因,包括基因缺陷、致畸劑及血管畸形等。其中多數(shù)研究都證實該病是由于基因突變引起的遺傳性疾病。而致病基因的確定也成了亟待解決的問題,研究者曾提出多種基因,但后期的研究均一一推翻,最近有學者又提出TCOF1為致病基因的可能性,但是否明確還需進一步證實。
　　眾所周知,BMMSCs作為一類重要的間充質(zhì)干細胞在生長

3、發(fā)育過程中起到重要的作用。目前的研究證明,BMMSCs不僅在骨形成方面,而且在免疫調(diào)控方面都有著重要的作用。而越來越多的研究都證實基因的缺陷以及微環(huán)境的改變均可以影響干細胞的生物學行為,分化及功能,從而導致發(fā)育的缺陷,因此,疾病干細胞的研究對遺傳性疾病的研究有著重要的作用。
　　研究目的：
　　1.通過病史采集、臨床檢查,觀察和分析患者頜面部發(fā)育的異常表現(xiàn)。
　　2.驗證以往文獻報道的TCOF1基因為該病致病基因的準確

4、性。
　　3.探討患者患側(cè)與健康側(cè)頜骨hBMMSCs的生物學行為和多向分化能力的差異。
　　4.探討患側(cè)與健康側(cè)頜骨hBMMSCs的免疫調(diào)控能力的差異。
　　研究方法：
　　1.我們經(jīng)統(tǒng)一的診斷標準,經(jīng)過全面和詳盡的問診,臨床檢查,收集 HFM患者14例,并運用OMENS分類法通過對臨床特征和器官受累情況進行分類。在患者及家屬知情同意情況下,我們抽取患者靜脈血2ml,提取全基因組DNA,對目前報道的可疑致病基因T

5、COF1的26個外顯子進行測序,驗證其正確性。
　　2.在患者及家屬知情和不影響患者手術(shù)效果的情況下,我們在患者進行正頜手術(shù)過程中,取得患者頜骨健康側(cè)和患側(cè)的組織,利用組織塊方法分離培養(yǎng)hBMMSCs。并以正常人的下頜骨 hBMMSCs作為正常對照組,首先利用流式細胞技術(shù)檢測表面分子的表達,然后對各組細胞的生物學行為進行比較。通過克隆集落形成實驗、MTT檢測和EDU檢測細胞增殖能力。進行成神經(jīng)誘導后,通過免疫細胞化學實驗從蛋白水平

6、上檢測hBMMSCs多向分化能力。Real time-PCR和Western Blot檢測分析成骨成脂誘導后標志性基因的表達。并且將不同組 hBMMSCs與 TA/TCP混合后植入裸鼠皮下,8周后取材,進行組織學觀察,HE染色觀測體內(nèi)類骨質(zhì)形成情況。
　　3.利用ELISA檢測上述各組hBMMSCs培養(yǎng)液上清的INF-γ、IL-6、IL-10及IL-17的表達,并通過Real time RT-PCR檢測這些驗證因子在各組hBMMS

7、Cs中的表達變化。我們把各組hBMMSCs和T淋巴細胞進行直接共培養(yǎng),檢測共培養(yǎng)后的T淋巴細胞的周期,觀察各組細胞對T淋巴細胞增殖的影響情況。構(gòu)建DSS炎癥性結(jié)腸炎小鼠模型,并于模型建立的第三天一次性注射各組hBMMSC,每日觀察小鼠的體重,大便,疾病發(fā)生狀況,并于第十天處死小鼠后,對其結(jié)腸進行病理學觀察,以確定各組hBMMSC對小鼠模型的治療情況。
　　實驗結(jié)果：
　　1.由于 HFM疾病臨床表現(xiàn)復雜,且發(fā)病表型與多個其他

8、頜面遺傳病相似,我們經(jīng)過詳盡檢查,收集14例患者,運用OMENS對其臨床表型進行分類后,我們發(fā)現(xiàn)即使同一患者,其各個器官的受累程度也各不相同。通過對可疑基因TCOF1的26個外顯子測序,將測得的基因序列進行核酸序列的同源性比較分析,排除SNP位點,我們認為TCOF1并非為HFM的致病基因。
　　2.分離培養(yǎng)的各組頜骨hBMMSCs間充質(zhì)細胞表面標志物表達陽性?？寺〖?、MTT、EDU檢測、流式細胞檢測結(jié)果顯示患者患側(cè)hBMMSCs

9、的增殖能力減弱,低于正常對照組和患者健側(cè)的hBMMSCs。成骨、成脂、成軟骨誘導分化證明,培養(yǎng)的hBMMSCs具有多向分化能力。而通過對各組細胞的比較,發(fā)現(xiàn)各組細胞在成神經(jīng)分化方面無明顯差異,而成脂和成骨誘導后,從RNA水平和蛋白水平,都觀察到患者患側(cè)hBMMSCs的分化能力明顯弱于正常對照組和患者健側(cè)組的hBMMSCs,而后兩組能力相當。
　　3.利用 ELISA檢測各組 hBMMSCs培養(yǎng)上清的炎癥因子表達水平發(fā)現(xiàn)患者患側(cè)hB

10、MMSCs的表達水平較高,而Real time RT-PCR對hBMMSCs的RNA水平檢測也得到了類似的結(jié)果。我們將與各組hBMMSCs共培養(yǎng)后的T細胞做周期檢測,發(fā)現(xiàn)患者患側(cè)hBMMSCs對T細胞的增殖的抑制作用不及正常對照組細胞和患者健側(cè)細胞。而通過 hBMMSCs治療 DSS炎癥性結(jié)腸炎模型鼠,我們觀察到患者患側(cè)hBMMSCs的免疫抑制能力下降,而患者健側(cè)細胞則表現(xiàn)出與正常對照組相似的能力。
　　結(jié)論:
　　通過對病

11、例的研究,我們發(fā)現(xiàn)即使同一HFM患者,其各個器官的受累程度也不盡相同。之前文獻中所報道的TCOF1基因并不是HFM的致病基因,而其致病基因還有待進一步探討?；颊呓】祩?cè) hBMMSCs的增殖與正常對照組相似,患者患側(cè)hBMMSCs的增值能力降低?；颊呋紓?cè)hBMMSCs的成脂和成骨分化能力明顯弱于正常對照組和患者健側(cè)組的hBMMSCs,而后兩組能力相當。患者患側(cè)hBMMSCs的成神經(jīng)能力與健側(cè)及正常對照組無差異。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)患者患側(cè) hBMM