純鈦表面堿處理對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、自從Branemark提出骨整合這一概念以來,鈦種植體作為缺牙修復(fù)的治療手段,顯著提高了患者的生存質(zhì)量。種植體骨結(jié)合是種植體成功行使功能的重要影響因素[1,2]。種植體表面的理化性能在種植體骨結(jié)合中起到重要作用[3-6],從組織學(xué)和細(xì)胞水平探討種植體與骨結(jié)合過程已成為關(guān)注的熱點?，F(xiàn)階段的研究表明:純鈦表面形貌[7-9]、粗糙度[10-12]、親水性[13-17]及理化特性均對細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生重要影響,進而影響種植體的骨整合[8,18

2、]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。許多研究者都將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨修復(fù)的成骨分化來源細(xì)胞[19,20]。本研究用梯度濃度NaOH溶液對純鈦試件進行堿處理,觀察不同濃度 NaOH溶液處理對純鈦試件表面納米結(jié)構(gòu)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。將制備的純鈦試件打磨至2000目。隨機分為實驗組和對照組,實驗組進行梯度濃度(2.5M,5M,7.5M,10M,12.5M)

3、NaOH溶液處理。用掃描電子顯微鏡(SEM)、掃描探針顯微鏡(SPM)對改性后實驗組的表面形態(tài)觀察分析,能量色散X射線光譜儀(EDX)分析表面元素組成及各元素所占比例。用體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察堿處理后純鈦試件不同表面對細(xì)胞黏附、增殖、細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶(ALP)活性和細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)礦物質(zhì)沉積的影響,用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)分析(ELISA)測定骨鈣素(OCN)的產(chǎn)出量,用RT-PCR方法檢測了不同表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨相

4、關(guān)基因的表達。
　　結(jié)果如下:
　　1.堿處理后的各實驗組純鈦試件表面均形成了形貌相似的多孔納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。高倍SEM圖像顯示不同濃度NaOH溶液處理后純鈦試件表面的形貌細(xì)節(jié),此相似的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大小從2.5M組到10M組逐漸減小,在最高濃度12.5M組已不能形成均勻的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。AFM檢測的表面粗糙度(Ra)也呈現(xiàn)出相似的趨勢,從2.5M組到10M組逐漸減小,但12.5M組較10M組略有增大。接觸角隨著堿處理濃度的升高由

5、40°降到6°,但在12.5M組略有升高。堿處理后試件經(jīng)X線能譜(EDX)檢測分析,結(jié)果顯示其表面主要成分為Ti元素及微量的Na和Si元素。各實驗組間Na元素含量無明顯差異。
　　2.試件蛋白吸收檢測,發(fā)現(xiàn)實驗組的蛋白吸收明顯優(yōu)于對照組,且隨著堿溶液濃度的增加而增加,10M組達到頂峰,12.5M組略有下降。
　　3.細(xì)胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在實驗組試件表面在30min、1h和3h的早期黏附明顯高于對照組試件表面。細(xì)胞

6、在實驗組試件表面的早期增殖也明顯高于對照組試件表面,且細(xì)胞在10M組的增殖能力最強。
　　4.細(xì)胞短期培養(yǎng)30min、1h、3h后,細(xì)胞形態(tài)呈相似的紡錘體狀,但偽足的伸展表現(xiàn)出顯著的差異。實驗組試件表面培養(yǎng)細(xì)胞偽足的數(shù)量和長度隨堿處理濃度的增加而增加,10M處理組試件表面培養(yǎng)細(xì)胞偽足數(shù)量及伸展長度表現(xiàn)最好。細(xì)胞經(jīng)過3d的培養(yǎng)后,實驗組和對照組試樣表面培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)已發(fā)生改變。對照組的細(xì)胞還保持著紡錘體形態(tài),且板狀偽足的數(shù)量也較少。

7、實驗組的細(xì)胞已經(jīng)鋪展,且伸展出較多的板狀偽足。
　　5.1w和2w的ALP染色及ALP活性的實驗結(jié)果顯示,對照組和實驗組有顯著差異。3w和4w的茜素紅染色,細(xì)胞外基質(zhì)礦物質(zhì)沉淀以及酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)分析(ELISA)測定骨鈣素(OCN)的產(chǎn)出量,對照組和實驗組間也表現(xiàn)出顯著差異。
　　6.3d和7d的RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的骨涎蛋白(BSP)、骨結(jié)合素(ON)、2型轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(RUNX2)、I型膠原(

8、Co1-I)的表達均較對照組均顯著提高。
　　結(jié)論:純鈦試件表面經(jīng)堿(NaOH)處理后形成納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)的大小、表面粗糙度、濕潤性及蛋白吸附能力均與堿處理濃度的濃度有關(guān)。此納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯著地影響了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為如:黏附、增殖、ALP活性、細(xì)胞外基質(zhì)礦物質(zhì)沉淀、骨鈣素(OCN)的產(chǎn)出量以及成骨相關(guān)基因的表達。這些指標(biāo)均在NaOH濃度達到10M時升到峰值。本研究結(jié)果為下一步的動物實驗提供實驗依據(jù),并為以后的臨床應(yīng)用