癌--睪丸抗原OY-TES-1對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:了解癌-睪丸抗原OY-TES-1對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　(1)運(yùn)用不連續(xù)密度梯度離心法從人骨髓中分離MSCs，然后使用含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，聯(lián)合使用胰蛋白酶(Trysin)和EDTA對(duì)MSCs進(jìn)行消化傳代以獲得較單一的干細(xì)胞群;通過以下方法鑒定MSCs:顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、CCK8法檢測細(xì)胞生長情況、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)志物（CD105、CD90、C

2、D44、CD29、CD45、CD14和HLA-DR）、用條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)MSCs向成骨和成脂肪方向分化;采用5％DMSO凍存MSCs，并比較凍存前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、存活率、生長情況和表面分子標(biāo)志物的表達(dá)以了解凍存效果。
　　(2)采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法、細(xì)胞免疫熒光染色法及免疫印跡法(Western blot)檢測MSCs，從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平了解OY-TES-1的表達(dá);用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染OY-TES-1 siRN

3、A，RT-PCR和Western blot檢測MSCs中OY-TES-1基因的最佳干擾時(shí)間及干擾效率;觀察OY-TES-1基因干擾后MSCs的形態(tài)學(xué)特征，并了解MSCs相關(guān)表面分子標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　(3)通過CCK8法檢測細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡;用Western blot檢測周期相關(guān)調(diào)控蛋白Cyclin E和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3;用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能

4、力。
　　結(jié)果:
　　(1)通過不連續(xù)密度梯度離心法體外獲得了來源于骨髓的MSCs，經(jīng)培養(yǎng)及傳代后MSCs得到較好的純化，具有MSCs典型的形態(tài)學(xué)特征，表達(dá)系列MSCs相關(guān)表面分子標(biāo)志物（CD105、CD90、CD44和CD29），并呈現(xiàn)出向成骨和成脂肪方向的分化潛能。采用5％DMSO凍存MSCs的效果良好，復(fù)蘇后的細(xì)胞其形態(tài)特性、存活率及生長情況與凍存前相比無明顯改變，仍表達(dá)系列MSCs相關(guān)表面分子標(biāo)志物（CD105、CD

5、90、CD44和CD29）。
　　(2)在MSCs中均檢測到OY-TES-1 mRNA和蛋白，OY-TES-1蛋白分布于MSCs的胞質(zhì)和胞核。MSCs中OY-TES-1表達(dá)的下調(diào)不影響MSCs的形態(tài)學(xué)特征和MSCs相關(guān)表面分子標(biāo)志物的表達(dá)。
　　(3) OY-TES-1下調(diào)后，細(xì)胞增殖能力減弱、G1期細(xì)胞增多、S期和G2期細(xì)胞減少并伴隨Cyclin E表達(dá)的下降、細(xì)胞凋亡率增加且伴隨Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，以及細(xì)胞遷移能

6、力下降等，與其余實(shí)驗(yàn)組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，這些結(jié)果表明MSCs中OY-TES-1的下調(diào)，影響了MSCs的增殖、周期分布、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞的遷移能力，提示OY-TES-1可能參與MSCs的這一系列生物學(xué)行為，但具體機(jī)制尚不清楚。
　　結(jié)論:(1)體外對(duì)MSCs進(jìn)行培養(yǎng)、連續(xù)傳代、鑒定及凍存，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了大量的種子細(xì)胞。(2)證實(shí)了MSCs中OY-TES-1的表達(dá);所建立的RNAi方法能有效地下調(diào)MSCs中的OY-T