喉黏膜慢性炎癥組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為觀察.pdf

1、聲帶外傷、感染等均可使聲帶固有層受到損害,影響發(fā)聲。如何預(yù)防和減少聲帶萎縮及聲帶在修復(fù)過程中疤痕的形成就成為了我們迫切需要改善并解決的一個重要問題。
　　人體組織內(nèi)成體干細(xì)胞的動態(tài)平衡及分化是組織器官再生修復(fù)的生物學(xué)基礎(chǔ)。人喉黏膜固有層中也存在著具有良好的自我更新能力及多向誘導(dǎo)潛能的細(xì)胞,我們稱其為喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(laryngealmucosamesenchymalstemcell,LM-MSCs)。我們設(shè)想將LM-MSCs植

2、入受損聲帶,實現(xiàn)原位干細(xì)胞移植,來進行聲帶損傷的修復(fù),是否會為聲帶損傷的患者帶來新的希望呢?因此本實驗組前期研究通過在聲帶損傷處植入熒光標(biāo)記的LM-MSCs,觀察其在聲帶內(nèi)的存活、轉(zhuǎn)歸以及對聲帶損傷的修復(fù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LM-MSCs在受損的聲帶固有層中存活時間長達(dá)8周以上,植入的細(xì)胞數(shù)量隨時間推移逐漸減少。有少數(shù)LM-MSCs在聲帶固有層內(nèi)轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞,參與了聲帶的損傷修復(fù)。實驗結(jié)果顯示LM-MSCs可在一定程度上減輕

3、聲帶的損傷。眾所周知,炎癥環(huán)境下機體自身難以完成疾病組織的自我再生修復(fù),因而聲帶局部炎癥環(huán)境下,聲帶固有層細(xì)胞的存活能力、細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變是否影響著聲帶損傷的修復(fù)呢?因此本實驗利用正常(下咽癌患者全喉切除手術(shù),無病變一側(cè)的正常聲帶標(biāo)本)及炎癥(聲帶息肉手術(shù)的標(biāo)本)喉黏膜組織,觀察LM-MSCs在正常及局部炎癥組織中的表達(dá)和分布以及組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變。并檢測通過有限稀釋法獲取的正常及炎癥來源的LM-MSCs在體外的增殖活性

4、、擴增效應(yīng)、克隆形成能力、多向分化能力等,比較正常和炎癥組織來源LM-MSCs生物學(xué)特性,明確炎癥微環(huán)境對LM-MSCs生物學(xué)特性的影響。為進一步揭示炎癥對LM-MSCs功能影響的分子機制及利用LM-MSCs解決聲帶組織缺損再生修復(fù)問題提供理論基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　分析比較正常及炎癥喉黏膜組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分的差異,觀察LM-MSCs在正常及炎癥喉黏膜組織中的表達(dá)和分布,并通過對正常及炎癥來源的LM-MSCs(H-

5、LM-MSCs和I-LM-MSCs)的鑒定及比較兩種LM-MSCs的增殖、分化能力,研究I-LM-MSCs的生物學(xué)特性,并探討炎癥微環(huán)境對LM-MSCs生物學(xué)行為的影響。
　　研究方法:
　　1.取正常及炎癥聲帶組織,組織塊石蠟包埋固定、切片。利用HE染色觀察正常及炎癥聲帶組織的大體結(jié)構(gòu)及炎癥浸潤后組織結(jié)構(gòu)的變化。并且通過Massontrichrome染色及ElastinVG染色分別觀察組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維及彈力纖維

6、的含量變化。
　　2.組織石蠟切片,通過免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光化學(xué)染色法檢測正常及慢性炎癥聲帶組織固有層中干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1的表達(dá)及分布。
　　3.利用組織消化、有限稀釋法獲取H-LM-MSCs和I-LM-MSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的干細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)。
　　4.通過MTT、克隆形成率計算及流式細(xì)胞儀檢測H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的細(xì)胞周

7、期及凋亡,同時比較兩種細(xì)胞的增殖能力。
　　5.將H-LM-MSCs和I-LM-MSCs分別進行成骨、成脂誘導(dǎo)。通過茜素紅染色、Ca2+定量、ALP染色比較不同來源LM-MSCs的成骨分化能力;通過油紅O染色,比較H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的成脂分化能力。
　　實驗結(jié)果:
　　1.正常聲帶組織HE染色可見聲帶組織由淺至深依次為復(fù)層鱗狀上皮、固有層、肌層,組織結(jié)構(gòu)清楚,細(xì)胞外基質(zhì)排列有序,炎癥聲帶組織HE染色

8、可見鱗狀上皮明顯增厚,固有層局部可見炎性細(xì)胞浸潤;細(xì)胞外基質(zhì)成分染色結(jié)果顯示(通過切片IOD值檢測):正常聲帶組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)排序整齊,Massontrichrome染色可見炎癥聲帶組織固有層膠原纖維增粗且排序紊亂,含量高于正常聲帶組織,ElastinVG染色可見彈力纖維變細(xì),并且含量低于正常。
　　2.對干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1進行免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示:正常及炎癥聲帶組織中均存在STRO-1的表達(dá),散在分布于組織固有

9、層及肌層,并且兩組聲帶組織中STRO-1陽性表達(dá)的數(shù)量無明顯差異。
　　3.在炎癥聲帶組織中同樣含有喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞,利用有限稀釋法得到的H-LM-MSCs和I-LM-MSCs外觀上都呈紡錘形的成纖維細(xì)胞樣,均具有一定的克隆形成能力,特異性干細(xì)胞表面分子標(biāo)記表達(dá)一致。
　　4.體外有限稀釋法單細(xì)胞培養(yǎng)的H-LM-MSCs和I-LM-MSCs均表現(xiàn)出自我更新能力;I-LM-MSCs組的克隆形成率高于正常組;MTT細(xì)胞生長曲線

10、和流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果均顯示I-LM-MSCs的增值能力明顯高于對照組;細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示H-LM-MSCs和I-LM-MSCs凋亡率無明顯差異。
　　5.茜素紅染色及定量、ALP染色及ALP活性檢測結(jié)果顯示,I-LM-MSCs成骨分化能力明顯低于H-LM-MSCs;油紅O染色結(jié)果顯示I-LM-MSCs成脂誘導(dǎo)后形成脂滴量明顯少于H-LM-MSCs,說明I-LM-MSCs的成脂分化能力降低。
　　結(jié)論:
　　1.本實

11、驗通過HE染色可見炎癥聲帶組織鱗狀上皮增厚,炎性細(xì)胞浸潤;Massontrichrome染色結(jié)果顯示炎癥聲帶組織固有層膠原纖維增粗且排序紊亂,含量高于正常聲帶組織;ElastinVG染色結(jié)果顯示彈力纖維變細(xì),并且含量低于正常。以上結(jié)果表明炎癥使聲帶組織上皮增生,固有層增厚,慢性炎癥致使聲帶組織的膠原含量增加,彈力纖維含量下降,最終導(dǎo)致聲帶組織瘢痕化加重、粘彈性降低。
　　2.免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示正常及炎癥聲帶組織固有層中散在干

12、細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1的表達(dá),并且表達(dá)量無明顯差異,說明聲帶固有層中確實存在干細(xì)胞群體。
　　3.本實驗從正常及炎癥聲帶組織中通過消化法、有限稀釋法成功獲得H-LM-MSCs和I-LM-MSCs,分離的細(xì)胞都具有一定的克隆形成能力,并且表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物。說明兩種喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞均表現(xiàn)出干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　4.正常及炎癥組織固有層間充質(zhì)干細(xì)胞均表現(xiàn)出自我更新的能力,但I-LM-MSCs的克隆形成率高于H-