炎癥微環(huán)境下人牙齦固有層間充質干細胞生物學特性的研究.pdf

1、牙齦是附著在牙頸和牙槽突部分的粘膜組織，呈現(xiàn)粉紅色，有光澤，質堅韌，是口腔粘膜的一部分。它擔負著牙周組織與口腔環(huán)境的粘膜屏障，維持口腔健康。從組織學和功能學上看，由于牙齦具有耐受咀嚼食物所產生的摩擦力的特性，因此它屬于咀嚼粘膜，以此和頰側的被覆粘膜和唇側粘膜得以區(qū)分。牙齦組織由上皮和固有層兩部分組成，固有層由顱神經嵴發(fā)育而成，與之同源還有顱面其它間充質來源的組織，包括牙乳頭和牙周組織。一些文獻中報導，大量的顱神經嵴來源的間充質干細胞已經

2、得到證實，它們無論在維持自身內環(huán)境穩(wěn)定上還是在再生治療中都可以發(fā)揮重要的作用。然而，盡管已經確認牙齦來源的細胞是上皮/原始干細胞，但是幾乎還沒有研究對牙齦來源的細胞鑒定為間充質干細胞。
　　目前一些對牙齦成纖維細胞的研究，認為還不能從其中區(qū)分出已經有證據存在的牙齦間充質干細胞。但是近期有文獻報導，已經可以成功從人牙齦組織中分離培養(yǎng)出牙齦間充質干細胞(gingivalmesenchymalstemcell，GMSC)。這些GMSC無

3、論是在體內環(huán)境還是在體外環(huán)境都顯示出自我更新，多向分化和免疫調節(jié)的能力。而這些特征正好與Fournier等人發(fā)表的文章中所闡述的牙齦成纖維細胞顯示出原始細胞的特性相似，包括體外低密度細胞形成克隆形成率（colonyformingunit-fibroblastic，CFU-F）和體內多向分化。當前，各種人的間充質干細胞已經獲得認可，并且應用于臨床治療中。早先的實驗認為運用分離和培養(yǎng)技術，間充質干細胞幾乎可以從人的器官和組織甚至從它們的胚胎

4、中獲得。
　　我們知道臨床上慢性牙齦炎導致的牙齦增生原因復雜，表現(xiàn)也較不均一，而正畸治療中出現(xiàn)的牙齦炎性增生屬于僅與牙菌斑有關的牙齦病，表型穩(wěn)定，炎癥是其發(fā)生發(fā)展的最主要原因。并且有研究表明，正畸治療和未經正畸治療牙齦炎性增生的發(fā)生率是沒有統(tǒng)計學差異，和矯治力無關，而與口腔衛(wèi)生相關，。
　　本課題旨在通過對人正常和牙菌斑導致的炎性增生牙齦的組織學，細胞學觀察，探討它們在原位的組織學特征和存在GMSC干細胞的標記物。然后從這兩

5、種牙齦組織中分離培養(yǎng)GMSC：正常牙齦間充質干細胞（gingivalmesenchymalstemcellfromnormalgingivaltissue，N-GMSC）、炎性增生牙齦間充質干細胞（gingivalmesenchymalstemcellfrominflammationofgingivalhyperplasiatissue，I-GMSC）應用單克隆分離和擴增方法，證明它們都具有克隆形成能力和高度增殖能力，比較N-GMSC和

6、I-GMSC成骨和成脂特性的差異，及其細胞外基質、相關蛋白酶、炎性因子的變化特點。建立炎癥微環(huán)境這一穩(wěn)定的系統(tǒng)，研究炎癥微環(huán)境對牙齦間充質干細胞的影響。初步探討正畸治療中牙齦炎性增生的發(fā)病機制，為探索新的預防和治療策略提供理論和實驗依據。
　　第一部分人正常牙齦和炎性增生牙齦組織學觀察
　　實驗一、人正常牙齦和炎性增生牙齦組織學觀察采用組織學方法觀察正常牙齦和炎性增生牙齦組織學特征。結果表明：正常牙齦組織，呈現(xiàn)粉紅色，有光澤

7、，質堅韌。炎性增生牙齦組織，牙齦充血，失去正常的解剖外形，并且紅腫增生。炎性增生牙齦HE組織切片顯示，其上皮釘突明顯，固有層大量淋巴細胞浸潤。
　　實驗二、人正常牙齦和炎性增生牙齦干細胞特異性標志物的比較采用免疫熒光組織化學方法原位觀察兩種牙齦組織和細胞爬片。結果發(fā)現(xiàn)：正常牙齦組織呈現(xiàn)出的干細胞的篩選標志-1（STROL-1）和早期胚胎糖脂抗-4（stage-specificembryonicantigen4，SSEA-4）含量大

8、于炎性增生牙齦組織，提示N-GMSC和I-GMSC存在各自組織中含量的差異，可能同時也具有骨/脂向分化潛力的差異；炎性增生牙齦組織細胞外基質Ⅰ型膠原（collagen-1，COL-1）含量大于正常牙齦組織，N-GMSC和I-GMSC細胞爬片的結果符合它們所來源的組織免疫熒光組織化學COL-1的染色結果，提示兩種組織的細胞外基質含量的差異，可能是造成它們的臨床出現(xiàn)的不同表型的原因。
　　第二部分人正常牙齦和炎性增生牙齦間充質干細胞分

9、離、培養(yǎng)和生物學特性的初步研究
　　實驗一、N-GMSC和I-GMSC的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定兩種來源牙齦間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定。采用酶消化法分離培養(yǎng)原代牙齦間充質干細胞。結果表明：離體的牙齦組織包含結構完整的間充質組織，表明本實驗使用的方法能夠分離出GMSC，它可以迅速貼壁，伸展后細胞形態(tài)呈長梭形或三角形。
　　實驗二、N-GMSC和I-GMSC體外培養(yǎng)生物學特性檢測采用有限稀釋法細胞接種于大培養(yǎng)皿中，通過克

10、隆形成率檢測，從而明確兩種狀態(tài)來源的牙齦組織中GMSC干細胞克隆形成的差異。流式細胞術（flowcytometric，F(xiàn)CM）分別檢測來源于間充質的N-GMSC和I-GMSC表面標志：陽性表達-STRO-1、CD29、CD44、CD90、CD105、CD146；陰性表達-CD34、CD45。檢測結果表明：N-GMSC和I-GMSC形成克隆的能力無明顯差異，但是在相同時間中N-GMSC克隆個體大于I-GMSC。提示炎癥導致的牙齦增生組織中

11、仍然存在間充質干細胞。N-GMSC表達的STRO-1、CD146高于I-GMSC，標志物的表達提示GMSC與來源于其他間充質組織（牙髓）的干細胞具有同源性，并且N-GMSC干細胞表達大于I-GMSC。
　　實驗三、N-GMSC和I-GMSC多向分化能力檢測采用堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性檢測、礦化結節(jié)染色、脂滴染色及逆轉錄聚合酶鏈式反應（reversetranscriptionpolymeras

12、echainreaction，RT-PCR）檢測成骨/成脂相關基因表達的方法，檢測了N-GMSC和I-GMSC在體外的分化能力。結果表明：N-GMSC在體外顯示了較I-GMSC更高的礦化和成脂能力。提示N-GMSC干細胞能力強于I-GMSC，I-GMSC干細胞能力降低，是因為在炎癥微環(huán)境中會促使GMSC提前進入瞬時擴增細胞（transit-amplyfingcells，TA）的狀態(tài)。
　　第三部分炎癥微環(huán)境對人正常牙齦組織來源的間

13、充質干細胞影響
　　實驗一、N-GMSC和I-GMSC增殖差異和以此特性建立體外穩(wěn)定的炎癥微環(huán)境。甲基噻唑基四唑檢測(methylthiazolyltetrazolium，MTT)以及細胞周期(cellcycle，CC)檢測明確N-GMSC和I-GMSC增殖能力差異，根據它們的增殖特點，確定用外源性炎性因子：白介素-1（nterleukin-1beta，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-alp

14、ha，TNF-α）建立體外穩(wěn)定的炎癥微環(huán)境的濃度，觀察N-GMSC在炎癥微環(huán)境中凋亡能力的變化。結果表明：I-GMSC增殖能力強于N-GMSC，符合炎性增生牙齦的組織學特點。炎癥環(huán)境對干細胞的影響是其中的炎性因子對它的影響，外源性炎性因子IL-1β(5ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)建立穩(wěn)定的炎癥微環(huán)境：MTT檢測N-GMSC在IL-1β(5ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)炎性因子作用下增殖最高，符合MTT和細胞周期

15、檢測結果顯示I-GMSC具有強增殖能力。我們還發(fā)現(xiàn)N-GMSC在炎性因子作用下凋亡增加，在成骨誘導分化階段，凋亡數(shù)量都會隨著作用時間的延長呈現(xiàn)增多的趨勢。
　　實驗二、N-GMSC和I-GMSC細胞因子基因表達差異的比較RT-PCR檢測N-GMSC和I-GMSC基因表達的差異。結果顯示：I-GMSC的基質金屬蛋白酶1/2（matrixmetalloproteinase1/2，MMP1/2）表達量減少；基質金屬蛋白酶抑制劑1/2（m

16、etallopeptidaseinhibitor1/2，TIMP1/2）、IL-1α/6、COL-1、TNF-α表達量增多。提示是否這些表達變化是GMSC在炎癥狀態(tài)中特有的變化趨勢？
　　實驗三、N-GMSC和對照組正常牙髓干細胞（normaldentalpulpstemcell，N-DPSC）在炎癥微環(huán)境中細胞因子基因表達的比較RT-PCR檢測N-GMSC和對照組N-DPSC在炎性微環(huán)境中基因表達。結果顯示：N-GMSC在體外炎

17、癥微環(huán)境中，MMP1/2的表達量變化與TIMP1/2的表達量變化成負相關，即炎性因子作用8h時TIMP1/2表達量最高，而同一時間測定的MMP1/2表達量最低。對照組的N-DPSC：MMP1/2隨著炎性因子作用時間，基因表達量逐漸增加，而TIMP1/2基因表達量逐漸減少。提示為GMSC在炎癥微環(huán)境中MMPs與TIMPs表達變化規(guī)律具有其特異性。隨著炎性因子的作用時間IL-1α/6、COL-1、TNF-α表達量增加。GMSC表達的IL-1

18、α相對DPSC的要強，而DPSC表達的IL-6相對GMSC的強。提示兩種組織來源的干細胞（GMSC、DPSC）在炎癥微環(huán)境中的表達IL-1α，IL-6表達量的差異，是不是因此造成它們所表達MMPs、TIMPs變化趨勢不同的原因呢?所以最終導致牙齦和牙髓在炎癥中表現(xiàn)出的不同表型，一個為組織的增生，一個為組織的液化。
　　實驗四、N-GMSC、N-GMSC(外源性炎性因子)、N-DPSC、N-DPSC(外源性炎性因子)細胞膜片裸鼠皮下

19、移植的實驗研究將N-GMSC、N-GMSC(外源性炎性因子)、N-DPSC、N-DPSC(外源性炎性因子)制成細胞膜片移植入裸鼠皮下，2周后取材。對其進行組織免疫熒光組織化學染色，以探討組織細胞膜片在體內MMP1、TIMP1表達含量符合體外基因表達的特點。牙齦與牙髓組織在炎癥中的表型不相同，它們的干細胞屬于組織特異的干細胞，在炎性微環(huán)境中它們的MMPs與TIMPs表達量的變化趨勢也是不同的。可以認為GMSC在炎癥微環(huán)境中MMPs與TIM