粘蛋白MUC15對肝癌惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 粘蛋白MUC15對肝癌惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用及機(jī)制研究
　　 研究背景和目的:
　　 肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)最常見最致命的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第六位，而死亡率則占腫瘤相關(guān)死亡的第三位，更是肝硬化病人死亡的首要原因。分期較早的腫瘤病人，可通過肝切除術(shù)、肝移植和射頻消融，得到有效的治療。但大部分病人診斷時既為晚期，因為血管癌栓、子灶、包膜不全和多中心發(fā)生等情況的存在，缺乏有效的治療，術(shù)

2、后仍有很高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，預(yù)后依然很差。因此，迫切需要探索新的治療方法，鑒定新的肝癌進(jìn)展分子標(biāo)記，以建立新的更好的分子分型分層系統(tǒng)，并深刻理解肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制，這對于選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼绞?，阻止腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延長患者生存十分重要。
　　 粘蛋白是一類古老的高分子量糖蛋白家族，通常分為胞漿型及膜型，常被高度的O型糖基化包被。生理條件下，大部分上皮細(xì)胞中具有粘蛋白的表達(dá)。一般說來，粘蛋白的功能主要涉及水合、潤滑和保護(hù)上皮表皮

3、。腫瘤研究中，早期粘蛋白家族成員多以血清標(biāo)記物的出現(xiàn)，為人們所熟知，如CA125(MUC16)，CA153(MUC1)等，這些成員多為分泌型粘蛋白。近年來，很多文獻(xiàn)報道膜型粘蛋白在炎癥向腫瘤的進(jìn)展過程中，起到了很重要的作用。膜型粘蛋白為一類具有單次跨膜結(jié)構(gòu)的粘蛋白家族成員，其N端位于胞外，可感受各種胞外信號如各種細(xì)胞因子、生長因子等的刺激，而C端位于胞漿內(nèi)，涉及多條信號通路的活化。膜型粘蛋白家族成員包括MUC1，MUC3A，MUC3B，

4、MUC4，MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17和MUC20。
　　 粘蛋白MUC15最初是從牛奶脂肪小泡的膜上被分離鑒定。在人類胎盤的發(fā)育過程中，MUC15的表達(dá)在胚胎晚期比胚胎早期要高，而且體外實驗表明其表達(dá)水平與絨毛膜的侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)外源的MUC15，能夠抑制滋養(yǎng)層樣細(xì)胞JAR和JEG-3的侵襲能力。但是有趣的是，有文獻(xiàn)報道在結(jié)腸腺癌的研究中，MUC15的表達(dá)異常升高的，并促進(jìn)人類結(jié)腸

5、癌細(xì)胞的惡性表型。那么，在肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中，粘蛋白MUC15的表達(dá)情況如何，將發(fā)揮如何的作用，尚未見報道。
　　 研究方法:
　　 1.搜集臨床肝癌標(biāo)本，通過real-time RT-PCR、western blot、免疫組化技術(shù)檢測MUC15在肝癌組織中轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平的表達(dá)情況;
　　 2.完善肝癌樣本的臨床病理資料及隨訪預(yù)后信息，進(jìn)行統(tǒng)計分析及預(yù)后分析，研究MUC15與臨床病理特征的相關(guān)性及對肝癌

6、總體生存及術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值;
　　 3.利用慢病毒系統(tǒng)，建立MUC15過表達(dá)及干擾細(xì)胞系，采用CCK8、劃痕實驗、transwell遷移小室、Matrigel侵襲小室實驗觀察高低表達(dá)MUC15對肝癌細(xì)胞體外對增殖、遷移與侵襲能力的影響;
　　 4.利用裸鼠皮下荷瘤及尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移膜型，研究高低表達(dá)MUC15對肝癌細(xì)胞體內(nèi)對增殖、轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　 5.利用real-time RT-PCR、Western

7、blot技術(shù)，結(jié)合細(xì)胞因子刺激、抑制劑實驗等方法，研究MUC15對MAPK及PI3K/Akt等信號通路的影響;
　　 6.利用real-time RT-PCR、Western blot、免疫熒光、免疫共沉淀、流式細(xì)胞分析等技術(shù)，研究MUC15與EGFR的關(guān)系及對其功能的影響;
　　 7.利用免疫組化方法，研究MUC15與p-Akt在肝癌樣本中的相關(guān)性，并研究兩者結(jié)合后，對肝癌預(yù)后判斷的價值。
　　 研究結(jié)果:

8、r>　　 1.肝癌臨床樣本中MUC15在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均較癌旁組織降低;
　　 2.MUC15低表達(dá)能夠預(yù)測更具侵襲性的臨床病理特征及肝癌病人更差的預(yù)后;
　　 3.過表達(dá)MUC15能有效抑制肝細(xì)胞的遷移與侵襲能力;干擾MUC15則能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力;
　　 4.MUC15通過阻斷PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)了MMP2、MMP7及TIMP2的表達(dá);
　　 5.MUC15與EGFR的相互作

9、用促進(jìn)了EGFR的入胞、泛素化降解，阻礙了其本身同源二聚體的形成，從而調(diào)節(jié)了PI3K/Akt信號通路的失活;
　　 6.MUC15與p-Akt在臨床樣本中同樣存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，結(jié)合兩者是強(qiáng)有力的肝癌預(yù)后預(yù)測因子;
　　 7.DNA甲基化部分解釋了HCC中MUC15 mRNA水平的降低。
　　 結(jié)論:
　　 本研究工作發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中粘蛋白MUC15在癌中較癌旁明顯低表達(dá)，我們運用大樣本HCC驗證，發(fā)現(xiàn)這種

10、低表達(dá)與肝癌的惡性臨床病理指標(biāo)存在明顯的相關(guān)性，進(jìn)一步的單因素及多因素分析顯示MUC15是獨立的術(shù)后預(yù)后風(fēng)險因素。體內(nèi)及體外的實驗進(jìn)一步證明過表達(dá)MUC15可以顯著的抑制肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，并且這種抑制能力主要是通過抑制PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的。我們首次報道了MUC15和EGFR的相互作用，這種相互作用明顯的減弱了EGF介導(dǎo)的EGFR的同源二聚化，并促進(jìn)了EGFR在早期胞吞小泡中的重定位，及EGFR的泛素化降解，然后抑制了A

11、kt介導(dǎo)的肝癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。
　　
　　 第二部分
　　 CHKA在肝癌惡性進(jìn)展中的作用與機(jī)制研究
　　 研究背景和目的:
　　 肝癌為世界第六大常見惡性腫瘤，這些年，隨著流行病學(xué)、影像學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的進(jìn)步，對肝癌的認(rèn)識從流行病、診斷、治療、發(fā)病機(jī)理上來說，均有了長足的進(jìn)步，但近年來肝癌相關(guān)的死亡率在全世界范圍內(nèi)仍呈現(xiàn)上升趨勢。大部分肝癌患者診斷時已經(jīng)是晚期，其總體生存率相比其他一些腫瘤仍然

12、很低。因為晚期腫瘤術(shù)后的高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，絕大多數(shù)肝癌患者并非死于原發(fā)灶，而主要是死于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。因此深入研究導(dǎo)致肝癌發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對于完善目前的臨床治療方案有積極的意義。
　　 膽堿激酶是脂類代謝中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵酶類。它是生物體細(xì)胞內(nèi)催化膽堿為磷酸膽堿，最終合成生物膜磷脂雙分子層的主要成分磷脂酰膽堿過程中的第一步關(guān)鍵酶。該酶由膽堿激酶α(CHKA)和膽堿激酶β(CHKB)兩個基因編碼，二者通過同二聚體或異二聚體

13、方式形成有活性的膽堿激酶。近年來，很多研究顯示膽堿激酶及其催化產(chǎn)物磷酸膽堿在多種腫瘤中呈高表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌及卵巢癌，并且發(fā)現(xiàn)CHKA的表達(dá)水平與乳腺癌、肺癌和膀胱癌患者的臨床預(yù)后存在相關(guān)性。一些研究小組還通過各種體內(nèi)外實驗證實CHKA具有癌基因的功能，這些結(jié)果均提示CHKA可能在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。然而，CHKA在肝癌中的表達(dá)情況如何，是否與臨床預(yù)后相關(guān)以及是否參與肝癌的惡性進(jìn)展過程，目

14、前國內(nèi)外尚未見有系統(tǒng)報道。
　　 本研究旨在為深入理解CHKA在肝癌惡性進(jìn)展過程中的作用提供實驗依據(jù)，并為肝癌的治療提供新的潛在靶點。
　　 研究方法:
　　 1.通過real-time qPCR技術(shù)檢測CHKA在肝癌組織的基因組水平和轉(zhuǎn)錄水平的拷貝數(shù)和表達(dá)豐度;
　　 2.通過Western blot手段和免疫組化方法檢測CHKA在肝癌組織中蛋白水平的表達(dá)情況;
　　 3.通過運用質(zhì)粒過表達(dá)技術(shù)

15、以及siRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)CHKA的表達(dá)水平觀察其對肝細(xì)胞增殖的影響;
　　 4.通過劃痕實驗、transwell遷移小室、Matrigel侵襲小室實驗觀察高低表達(dá)CHKA對肝癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響;
　　 5.結(jié)合抑制劑實驗和siRNA基因干擾實驗，研究CHKA調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的通路機(jī)制;
　　 6.應(yīng)用免疫組化方法結(jié)合臨床病例資料和隨訪數(shù)據(jù)，分析判斷CHKA的預(yù)后意義。
　　

16、研究結(jié)果:
　　 1.肝癌組織中CHKA基因拷貝數(shù)明顯高于癌旁組織，并且在肝癌組織中CHKA蛋白呈普遍高表達(dá);
　　 2.CHKA并不明顯影響肝癌細(xì)胞的增殖過程;
　　 3.過表達(dá)CHKA可使肝細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變;
　　 4.過表達(dá)CHKA能促進(jìn)肝細(xì)胞的遷移與侵襲能力;干擾CHKA則能有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力;
　　 5.過表達(dá)CHKA激活PI3K/Akt信號通路;干擾CHKA則明顯抑制P

17、I3K/Akt通路;
　　 6.抑制PI3K/Akt通路可明顯減輕CHKA介導(dǎo)的促遷移與侵襲能力;
　　 7.臨床肝癌組織中CHKA的高表達(dá)與腫瘤微血管侵犯和腫瘤分期有關(guān)，并預(yù)示著患者更短的總體生存時間和更早的腫瘤復(fù)發(fā)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究首先從臨床肝癌患者癌組織樣本入手，分析CHKA在肝癌中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)在肝癌基因組中CHKA拷貝數(shù)顯著增加，其蛋白產(chǎn)物在肝癌中呈普遍高表達(dá);隨后通過過表達(dá)及