Lgr5對(duì)胃癌的惡性生物學(xué)行為和化療耐藥性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,每年大約有100萬新發(fā)病例。胃癌在癌癥相關(guān)性死亡中排在第二位。近年來,盡管胃癌的診療技術(shù)不斷提高,由于胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致其5年生存率仍然低于30％。大量的研究認(rèn)為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移高度依賴于腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成,抗血管生成治療可以使胃癌患者生存獲益。此外,在治療進(jìn)展期胃癌過程中,術(shù)前化療被廣泛應(yīng)用,因?yàn)檫@種方法可以縮小腫瘤,降低腫瘤的分期,提高腫瘤的切除率,從而改善患者預(yù)后。然而

2、,由于化療耐藥性的存在,僅有20%的胃癌患者能夠完全或部分緩解。因此,為了提高胃癌的治療效果,需要尋找與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和化療耐藥性相關(guān)的特異分子并深入研究其調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　目的：
　　研究Lgr5在胃癌中的表達(dá)情況,分析其與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、化療耐藥性及預(yù)后的關(guān)系,并進(jìn)一步探討具體作用機(jī)制。此外,我們還對(duì)接受術(shù)前化療的胃癌患者進(jìn)行研究,探討Lgr5在評(píng)價(jià)化療效果及判斷預(yù)后方面的價(jià)值。
　　方法：<

3、br>　　1.收集318例經(jīng)根治性手術(shù)治療的胃癌患者,進(jìn)行隨訪。利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Lgr5、MMP2、EphA3、VEGF和CD34在318例胃癌和80例正常胃黏膜組織中的表達(dá)。CD34免疫染色用來計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)。通過Westernblot方法檢測(cè)了75例胃癌新鮮組織標(biāo)本及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中Lgr5,MMP2,EphA3和VEGF蛋白表達(dá)情況。并對(duì)Lgr5與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系進(jìn)行了綜合分析。
　　2.應(yīng)用

4、qRT-PCR和Westernblot技術(shù)篩選Lgr5高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株。通過RNA干擾技術(shù)敲低胃癌細(xì)胞中Lgr5的表達(dá)。通過qRT-PCR和Westernblot技術(shù)分析沉默Lgr5對(duì)MMP2,EphA3和VEGFmRNA和蛋白表達(dá)的影響。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默Lgr5基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖能力的影響。采用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默Lgr5對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。采用Transwell和細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察Lgr

5、5siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。利用MTT法和二維凝膠血管生成體外模型探討Lgr5沉默后的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbulicalveinendotheliacell,HUVEC)增殖和管狀結(jié)構(gòu)形成的影響。
　　3.采用MTT法和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Lgr5siRNA對(duì)接受奧沙利鉑和5-FU作用的胃癌細(xì)胞的存活率和凋亡率。收集68例接受新輔助化療的胃癌患者石

6、蠟標(biāo)本。通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)胃癌組織中Lgr5表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與該類患者的臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化染色結(jié)果顯示:Lgr5在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常粘膜組織(P=0.001)。Lgr5陽性率隨著侵潤(rùn)深度增加(T分期)而增高(P=0.001),并且與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.001)相關(guān)。多因素生存分析顯示Lgr5是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因子(P=

7、0.001)。通過Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)顯示Lgr5表達(dá)與MMP2、EphA3、VEGF和MVD呈正相關(guān)(P=0.001)。對(duì)Westernblot檢測(cè)結(jié)果行Pearson相關(guān)檢驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證這一相關(guān)性((Lgr5vsMMP2:P=0.001,r=0.875;Lgr5vsEphA3:P=0.001,r=0.474;Lgr5vsVEGF:P=0.001,r=0.921).
　　2.Lgr5在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中表達(dá)量最高。沉默A

8、GS細(xì)胞中Lgr5基因可以導(dǎo)致MMP2、EphA3和VEGF表達(dá)明顯下降(P=0.001)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)沉默Lgr5以后,AGS細(xì)胞的增殖、遷徙和遷移能力顯著降低(P=0.001),凋亡率顯著增高(P=0.001)。Lgr5沉默的胃癌AGS細(xì)胞培養(yǎng)液可以抑制HUVEC細(xì)胞增殖能力。此外,當(dāng)利用Lgr5沉默的AGS細(xì)胞上清液培養(yǎng)HUVEC時(shí),管狀結(jié)構(gòu)形成(2.51±0.19mm/mm2)相比空白對(duì)照組(7.34±0.30mm/mm2)和

9、陰性對(duì)照組(7.18±0.33mm/mm2)明顯減少,差異具有顯著性(P=0.001,P=0.001)。
　　3.在化療藥物奧沙利鉑和5-FU作用下,Lgr5基因沉默的AGS細(xì)胞的存活率較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下降(P=0.001),凋亡率較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著增加(P=0.001)。腫瘤消退情況差的胃癌中Lgr5陽性表達(dá)率顯著高于腫瘤消退情況好的胃癌(P=0.001)。將化療前后兩組Lgr5表達(dá)情況進(jìn)行配對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)化

10、療前Lgr5表達(dá)較化療后低(P=0.001)。多因素分析結(jié)果顯示Lgr5與接受術(shù)前化療的胃癌患者預(yù)后相關(guān),可以作為判斷預(yù)后的獨(dú)立因子(P=0.039)。
　　結(jié)論：
　　1.Lgr5與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),可以作為判斷胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成情況以及患者預(yù)后的參考指標(biāo)。
　　2.沉默Lgr5基因可以有效地抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。Lgr5沉默后胃癌AGS細(xì)胞培養(yǎng)液可以抑制HUVEC細(xì)胞增殖和管狀結(jié)構(gòu)

11、形成能力。Lgr5siRNA可以有效抑制β-catenin蛋白、MMP2、EphA3、VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)。這表明胃癌中Lgr5的表達(dá)可以通過激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而促進(jìn)MMP2、EphA3和VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄
　　3.Lgr5可以作為預(yù)測(cè)化療療效的有效指標(biāo),同時(shí)也可以作為獨(dú)立影響因子來判斷接受術(shù)前化療胃癌患者的預(yù)后。沉默Lgr5基因以后可以顯著降低AGS細(xì)胞的化療耐藥性。
　　4.Lgr