Lgr5在細胞重編程中作用和機制的研究.pdf

1、實驗目的:
　　1.確定成體干細胞標記物Lgr5對細胞重編程的作用。
　　2. LGR5作為G蛋白偶聯(lián)受體，是否存在合適配體參與影響細胞重編程。
　　3.探究LGR5影響細胞重編程的機制。
　　4.利用LGR5對細胞重編程的影響解決生物醫(yī)學難題。
　　實驗方法:
　　首先采用qPCR的技術(shù)手段，檢測Lgr5在小鼠各個組織細胞中的表達情況，根據(jù)表達情況構(gòu)建過表達載體或者敲低表達載體，過表達載體我們選擇構(gòu)

2、建在可以被強力霉素（Doxycycline，Dox）控制表達的pFUW-tet-on載體上，利用293T細胞以及psPAX2和pmd2.G的病毒包裝質(zhì)粒實現(xiàn)病毒的包裝和獲得，利用病毒感染的方式，直接感染小鼠胚胎多能性干細胞或者建立Lgr5過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)小鼠胚胎多功能干細胞細胞株，在此基礎上探測Lgr5過表達對小鼠胚胎多能干細胞的影響，同樣Lgr5的敲低表達載體按照同樣的方法。對于小鼠胚胎多能干細胞的影響，我們主要通過觀察細胞物理形態(tài)和檢測

3、多能干細胞的多能標記基因（marker）Nanog、Oct4、Rex1、Fgf5等。針對Lgr5對細胞重編程的影響，我們利用小鼠的胚胎成纖維細胞作為體細胞重編程的起始細胞，利用已經(jīng)成功建立的誘導體系，獲得能夠直接添加強力霉素啟動內(nèi)源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc表達來誘導細胞發(fā)生重編程的小鼠胚胎成纖維細胞，利用病毒感染的方法完成對此細胞Lgr5的過表達或者敲低，進而進行細胞重編程，對重編程得到的克隆的形成的速率和效率進行統(tǒng)計比

4、較，密切觀察記錄細胞出現(xiàn)克隆的日期。為了探究Lgr5影響細胞重編程的機制，我們篩選了跟Lgr5相關(guān)的一些蛋白。LGR5作為G蛋白耦聯(lián)受體，參與Wnt信號通路，而Wnt信號通路對于細胞干性維持有重要作用，RSPO3作為LGR5的同源配體，與其共同作用參與Wnt信號通路，同樣方法檢測Rspo3過表達對于重編程效率和小鼠胚胎多能干細胞的影響。利用熒光定量PCR和Western Blot在RNA水平和蛋白水平檢測Wnt通路中核心因子β-cate

5、nin的相關(guān)變化。利用ChIP-seq深度解析不同類型細胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列，分析LGR5和RSPO3參與Wnt通路調(diào)控的下游靶基因，揭示Lgr5在細胞重編程中的作用機制。
　　實驗結(jié)果：
　　1. Rspo3過表達能夠促進小鼠胚胎成纖維細胞的重編程效率。
　　2. Lgr5和 Rspo3在小鼠胚胎干細胞中過表達后能夠上調(diào)胚胎干細胞多能性標記基因的表達。
　　3.在小鼠胚胎干細胞中過表達Lgr5基因，