肥大細(xì)胞參與Lgr5+結(jié)直腸癌干細(xì)胞干性維持作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、第一部分 Lgr5+、RSPO-1、C-kit在人類(lèi)結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：探討人類(lèi)結(jié)直腸癌組織中浸潤(rùn)型肥大細(xì)胞的表達(dá)情況，及其分泌的RSPO-1蛋白的表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系。
　　方法：2012年3月~2012年4月，收集結(jié)直腸癌、癌周組織及手術(shù)近端切緣組織標(biāo)本21例，采用免疫組織化學(xué)染色方法、雙標(biāo)免疫熒光方法和免疫蛋白印跡法檢測(cè)各組織中RSPO-1和C-kit蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)RSP

2、O-1和Lgr5的mRNA的表達(dá)。比較肥大細(xì)胞及其表達(dá)的RSPO-1與臨床病理特征。
　　結(jié)果：免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RSPO-1在結(jié)直腸癌組織、癌周組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.48％和100%，高于手術(shù)近端切緣組織的80.95%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）；C-kit在癌周組織、手術(shù)近端切緣組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為100%和80.95%，高于癌組織28.57%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）；癌周組織中C-kit的強(qiáng)陽(yáng)性

3、（++）表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分站情況呈正相關(guān)（P值分別為0.02和0.015），而RSPO-1的強(qiáng)陽(yáng)性（++）表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和分期無(wú)明顯相關(guān)性（P值分別為0.194、0.114、0.5、0.44）；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫蛋白印跡檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中 Lgr5的相對(duì)表達(dá)也明顯高于癌周組織，癌周組織中的RSPO-1相對(duì)表達(dá)量明顯高于腫瘤及近端切緣組織。
　　結(jié)論人類(lèi)結(jié)直腸癌局部環(huán)境中的具有浸潤(rùn)型

4、肥大細(xì)胞，同時(shí)也表達(dá)RSPO-1，癌周組織局部環(huán)境中浸潤(rùn)型肥大細(xì)胞的密度與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分站呈正相關(guān)；人類(lèi)結(jié)直腸癌組織中的受體 Lgr5呈明顯高表達(dá)狀態(tài)。因此，浸潤(rùn)型肥大細(xì)胞分泌的 RSPO-1可能與結(jié)直腸癌干細(xì)胞表面受體 Lgr5結(jié)合共同維持結(jié)直腸癌干細(xì)胞突變的穩(wěn)定性及部分惡性生物學(xué)效應(yīng)。
　　第二部分肥大細(xì)胞參與小鼠結(jié)腸癌干細(xì)胞干性維持的研究
　　目的：浸潤(rùn)型肥大細(xì)胞介導(dǎo)的 RSPO-1在小鼠結(jié)直腸癌干細(xì)胞系

5、CT-26(wt)中影響Wnt/β-catenin信號(hào)通道的機(jī)制研究
　　方法：培養(yǎng)小鼠浸潤(rùn)型肥大細(xì)胞系P815，小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT-26；將普通CT-26細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清懸浮培養(yǎng)獲得球細(xì)胞：提取細(xì)胞RNA進(jìn)行干性檢測(cè)；將P815細(xì)胞系通過(guò)不同濃度SCF進(jìn)行刺激懸浮培養(yǎng)，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)檢測(cè)RSPO-1等目的蛋白的表達(dá)情況；將CT-26球細(xì)胞與P815細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清不同干預(yù)懸浮共培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況后提取CT-26球細(xì)胞的總RNA及蛋

6、白質(zhì)，用Real-time PCR、Western-blot檢測(cè)細(xì)胞系中β-catenin、TCF1/4、c-Myc mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：Western-Blot顯示小鼠浸潤(rùn)型肥大細(xì)胞系P815在受到10ng/ml的SCF刺激后48h表達(dá)的RSPO-1明顯升高，伴隨著SCF濃度的增加和刺激時(shí)間的增加，RSPO-1表達(dá)無(wú)明顯增高趨勢(shì)；受SCF刺激后Gremlin及Noggin不表達(dá)；Real-time PCR檢測(cè)CT

7、-26球細(xì)胞受到RSPO-1刺激后的球細(xì)胞CD133+及SOX2干性標(biāo)記物表達(dá)明顯高于未受刺激及阻斷RSPO-1的細(xì)胞群；Western-Blot顯示：CT-26球細(xì)胞與P815細(xì)胞系懸浮共培養(yǎng)后下游 Wnt/β-catenin信號(hào)通道活化，胞漿及胞核內(nèi)的β-catenin、Tcf4及c-Myc蛋白明顯高于較未受刺激及阻斷組細(xì)胞系。
　　結(jié)論小鼠肥大細(xì)胞介導(dǎo)的RSPO-1可刺激結(jié)腸癌干細(xì)胞下游Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活

8、化，β-catenin在胞漿累積進(jìn)入胞核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子TCF/Lef家族成員，因此肥大細(xì)胞介導(dǎo)的RSPO-1對(duì)結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的“干性”維持具有重要作用。
　　第三部分肥大細(xì)胞參與Lgr5+小鼠結(jié)腸炎癌模型中Wnt/β-catenin通路活化的研究
　　目的：浸潤(rùn)型肥大細(xì)胞介導(dǎo)的 RSPO-1在小鼠 Lgr5+結(jié)直腸炎癌模型中影響Wnt/β-catenin信號(hào)通道的機(jī)制研究
　　方法：通過(guò)經(jīng)典的化學(xué)誘導(dǎo)法（AOM+2%

9、DSS）構(gòu)建Balb/c雌性小鼠結(jié)腸炎癌模型。觀察生長(zhǎng)情況后，分別在第8周、16周和32周通過(guò)免疫組化和流失細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠Lgr5+結(jié)腸癌及癌周組織中肥大細(xì)胞數(shù)量和β-catenin、TCF4、c-Myc基因表達(dá)情況。通過(guò)Western-blot方法檢測(cè)小鼠結(jié)腸癌組織、癌周組織及正常組織的RSPO-1表達(dá)情況。
　　結(jié)果：入組的雌性小鼠在第32周成瘤率為20%（2/10）；Balb/c小鼠注射AOM及飲2%DSS后2和4周，死亡率

10、分別達(dá)到20%（2/10）和40%（4/10）；對(duì)比正常組或炎癥組（僅 DSS誘導(dǎo)），Lgr5+結(jié)腸上皮細(xì)胞（CD45-、CD31-、CD326+）的比例及其Wnt//β-catenin信號(hào)通路的活化水平均明顯增加；AOM+2%DSS誘導(dǎo)組的結(jié)腸癌模型小鼠其β-catenin、TCF、c-Myc明顯增高，浸潤(rùn)肥大細(xì)胞定位于結(jié)腸癌侵襲生長(zhǎng)的邊緣，其分泌的RSPO-1蛋白明顯增高。
　　結(jié)論小鼠結(jié)腸炎癌模型中肥大細(xì)胞介導(dǎo)的RSPO-1