外加電場(chǎng)干預(yù)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞部分生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景和目的:血管損傷后新生內(nèi)膜形成是血管再狹窄(restenosis,RS)等病變的病理基礎(chǔ),嚴(yán)重影響了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)的遠(yuǎn)期療效,因而對(duì)RS的防治成為心血管病領(lǐng)域研究的重要課題.RS發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,球囊損傷,局部血管內(nèi)膜撕裂,加之繼發(fā)的炎癥刺激,使局部血管組織細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變,損傷的內(nèi)膜創(chuàng)面不能及時(shí)修復(fù),中膜層血管平滑肌細(xì)胞(vascul

2、ar smooth muscle cells,VSMCs)通過損傷的內(nèi)彈力層向內(nèi)膜下遷移,并發(fā)生增殖,最后導(dǎo)致增生的新生內(nèi)膜形成.有效干預(yù)損傷局部血管組織細(xì)胞的生物學(xué)行為,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù),抑制VSMCs向內(nèi)膜下的遷移,是RS防治研究的重要內(nèi)容之一.對(duì)胚胎發(fā)育中組織形成、炎癥反應(yīng)及損傷修復(fù)的細(xì)胞生物學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),局部組織或細(xì)胞存在著內(nèi)生性電場(chǎng)(electirc fields,Efs),這一Efs正常時(shí)處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài).在一定因素作

3、用下,如處于組織的胚胎發(fā)育期、損傷及炎癥因子作用等,可改變局部的電場(chǎng)平衡,形成電位差,使細(xì)胞定向、有序生長(zhǎng),是最終形成組織或修復(fù)組織的一個(gè)重要條件.關(guān)于Efs對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為影響的進(jìn)一步研究表明,在Efs作用下,細(xì)胞順Efs方向進(jìn)行恰當(dāng)?shù)内吇\(yùn)動(dòng),在胚胎期主要是形成組織和器官,而在成年動(dòng)物則主要參與組織的損傷修復(fù).血管RS的發(fā)生中,VSMCs通過損傷的彈力纖維層向內(nèi)膜下遷移并發(fā)生增殖是其關(guān)鍵因素之一,因此,對(duì)RS發(fā)生中有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為

4、的干預(yù)和調(diào)節(jié)就是其防治的最關(guān)鍵環(huán)節(jié).局部Efs對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為有著明顯影響,使細(xì)胞定向遷移,那么,可不可以通過外加局部Efs的方式,在血管RS的防治中應(yīng)用Efs的這一作用呢?該課題擬設(shè)計(jì)制作體外干預(yù)Efs發(fā)生裝置,利用該裝置作用于培養(yǎng)的大鼠VSMCs,研究Efs對(duì)VSMCs遷移、增殖行為的影響,以及Efs影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制.為調(diào)控VSMCs遷移行為尋找新的方法和技術(shù).方法:(1)參考國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,改進(jìn)外加Efs干預(yù)裝置,包括

5、電源、電極系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)室,可以模擬生理Efs,作用于培養(yǎng)的VSMCs,并能在顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞行為的改變.(2)采用膠元酶消化法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMCs,較早期傳代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).(3)采用Efs干預(yù)培養(yǎng)的VSMCs,細(xì)胞置于顯微鏡培養(yǎng)條件或細(xì)胞培養(yǎng)箱中.CCD間斷顯微細(xì)胞圖象記錄和分析,研究不同強(qiáng)度Efs、不同作用時(shí)間對(duì)VSMCs遷移和細(xì)胞形態(tài)的影響.采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察Efs作用后VSMCs PCNA表達(dá)情況,研究細(xì)胞增殖

6、改變.(4)CCD間斷顯微細(xì)胞圖象記錄和分析,研究不同細(xì)胞生長(zhǎng)因子、不同濃度AngⅡ參與情況下,Efs對(duì)VSMCs遷移行為的影響.(5)采用免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫熒光染色方法檢測(cè)Efs干預(yù)后,與VSMCs遷移密切相關(guān)的PDGFR、AT1R和AT2R等受體的表達(dá)情況,研究Efs影響VSMCs發(fā)生的機(jī)制.(6)采用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)Efs干預(yù)后,與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)行為有關(guān)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架F-actin的表達(dá),研究Efs作用的可能機(jī)制.結(jié)果:(1)改進(jìn)

7、并制作Efs干預(yù)裝置,使電源可以輸出微安級(jí)強(qiáng)度的直流Efs,精確可調(diào),模擬生理Efs;電極系統(tǒng)具有良好的導(dǎo)電性,可避免電極電解產(chǎn)物進(jìn)入培養(yǎng)基,保持培養(yǎng)基的穩(wěn)定性;細(xì)胞培養(yǎng)室明顯提高局部電阻,最大限度保證局部環(huán)境穩(wěn)定,減少生理Efs的電流和歐姆熱,可以保證細(xì)胞在培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期存活,并能在顯微鏡下觀察細(xì)胞行為.以上條件保證Efs干預(yù)條件穩(wěn)定可靠,可用于Efs影響VSMCs行為的研究.(2)采用膠元酶消化法進(jìn)行大鼠主動(dòng)脈VSMCs的原代培養(yǎng),

8、所得細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)穩(wěn)定,經(jīng)形態(tài)學(xué)和α-SM-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定證實(shí)為VSMCs,采用較早期傳代細(xì)胞進(jìn)行研究.(3)在含有10﹪FBS的培養(yǎng)基中,細(xì)胞在Efs作用下顯示明顯的趨化反應(yīng).在100~250mV/mm Efs中,細(xì)胞向陰極遷移.對(duì)單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán),在150mV/mm,細(xì)胞定向遷移的速度沒有明顯提高.150mV/mm Efs長(zhǎng)時(shí)間作用于培養(yǎng)的VSMCs,細(xì)胞向陰極遷移的距離明顯高于無Efs作用對(duì)照組,細(xì)胞向陽極遷移受到

9、抑制.Efs作用下,部分細(xì)胞的片狀偽足向陰極面伸展.細(xì)胞向陰極遷移,需要培養(yǎng)基中血清存在.在無血清的培養(yǎng)基中,細(xì)胞在250mV/mm Efs中沒有定向遷移.(4)150mV/mm Efs長(zhǎng)時(shí)間作用于培養(yǎng)的VSMCs,在24、48、72小時(shí),細(xì)胞PCNA表達(dá)與對(duì)照培養(yǎng)細(xì)胞未見明顯差異.(5)在無血清培養(yǎng)基中補(bǔ)充PDGF-BB、bFGF、TGF-β1時(shí),部分恢復(fù)細(xì)胞向陰極遷移.其中PDGF-BB的作用較強(qiáng),與DMEM培養(yǎng)VSMCs相比,DM

10、EM + PDGF-BB培養(yǎng)VSMCs向陰極遷移明顯增強(qiáng),但仍然低于DMEM +10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs.bFGF和TGF-β1作用類似.(5)在150mV/mmEFs中,DMEM +10﹪FBS +10<'-6>、10<'-7>mol/L AngⅡ培養(yǎng)VSMCs明顯向陰極遷移,與DMEM +10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs相差顯著.DMEM+10<'-6>、10<'-7>mol/L AngⅡ培養(yǎng)VSMCs在Efs中遷移速度增加,沒有定向改

11、變.(6)Efs 150mV/mm,干預(yù)DMEM+10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs ,細(xì)胞內(nèi)PDGFR表達(dá)增加,部分細(xì)胞內(nèi)PDGFR表現(xiàn)為不對(duì)稱分布,集中在細(xì)胞朝向Efs陰極面的胞漿中.PDGFR上調(diào)在Efs作用5分鐘即出現(xiàn),可持續(xù)6小時(shí).(7)Efs 150mV/mm,干預(yù)DMEM+10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs ,細(xì)胞內(nèi)AT1R表達(dá)增加,可持續(xù)6小時(shí)以上,沒有發(fā)生細(xì)胞不對(duì)稱分布.AT2R表達(dá)沒有改變.(8)EFs150mV/mm,干預(yù)DMEM

12、+10﹪FBS培養(yǎng)VSMCs,激光共聚焦顯微鏡顯示Efs作用5分鐘,胞漿內(nèi)F-actin分布即開始改變,逐漸呈平行排列,形成整齊的應(yīng)力纖維絲.定量分析顯示Efs作用使細(xì)胞內(nèi)F-actin表達(dá)增加,30~60分鐘達(dá)到高峰,以后F-actin表達(dá)仍然高于正常對(duì)照.結(jié)論:(1) 改進(jìn)制作體外Efs干預(yù)裝置:微安級(jí)精確調(diào)控穩(wěn)壓穩(wěn)流電源、可施加Efs干預(yù)的體外培養(yǎng)細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)槽.可以模擬體內(nèi)生理Efs作用,適應(yīng)實(shí)驗(yàn)需要.(2)外加直流Efs干預(yù)

13、下,大鼠VSMCs發(fā)生形狀改變和定向遷移.細(xì)胞膜向陰極方向伸展,分散細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)在Efs中遷移相似.定向遷移依賴于Efs強(qiáng)度.(3) 生理強(qiáng)度的直流Efs對(duì)VSMCs增殖沒有明顯影響.(4)Efs誘導(dǎo)的VSMCs定向遷移依賴于血清的存在,血清中的生長(zhǎng)因子與Efs協(xié)同作用,促進(jìn)細(xì)胞向陰極遷移. (5)Efs作用下,細(xì)胞PDGFR表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)重分布,可能與細(xì)胞定向遷移的啟動(dòng)和維持有關(guān).(6) AngⅡ提高Efs中VSMCs遷移的速度,但