CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的表達及其對腫瘤生物學行為影響的研究.pdf

1、背景:
　　子宮平滑肌肉瘤(uterine leiomyosarcoma，ULMS)是臨床上發(fā)病率較低的婦科惡性腫瘤，但它是子宮體最常見的肉瘤之一，占子宮全部惡性腫瘤的1.5％，約占子宮肉瘤的40％。其特點為轉(zhuǎn)移發(fā)生早，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。細胞周期蛋白依賴性激酶亞基2(cyclin-dependent kinase subunit，CKS2)是廣泛分布于真核生物細胞中的小分子蛋白，在哺乳動物早期胚胎發(fā)育、減數(shù)分裂和體細胞分裂中起重要

2、作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，CKS2在結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中都存在過度表達的情況，并對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，但關(guān)于CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的研究尚未見報道。本研究主要探討子宮平滑肌肉瘤中CKS2的表達情況及其臨床意義，并探究CKS2在子宮平滑肌肉瘤細胞中的作用及其作用機制。
　　第一部分 CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的表達及其臨床意義
　　方法:
　　1.收集山東大學齊魯醫(yī)院和山東省立醫(yī)院2005年-2

3、015年之間38例子宮平滑肌肉瘤病例以及對照組38例子宮平滑肌瘤，完善病例臨床資料。
　　2.利用免疫組化方法檢測子宮平滑肌肉瘤組和子宮平滑肌瘤組中CKS2蛋白的表達情況，并將免疫組化結(jié)果根據(jù)Formwitz評分標準進行評分。
　　3.根據(jù)兩組免疫組化評分結(jié)果，比較子宮平滑肌肉瘤組和子宮平滑肌瘤組中CKS2蛋白表達情況的差異;將子宮平滑肌肉瘤分為高表達組（≥4分）和低表達組（＜4分），統(tǒng)計分析CKS2蛋白的表達水平與子宮平滑

4、肌肉瘤患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.CKS2在子宮平滑肌肉瘤和子宮平滑肌瘤中的表達主要定位于細胞核中。CKS2在子宮平滑肌肉瘤中高表達率為63.2％(24/38)，在平滑肌瘤中高表達率為18.4％(7/38)。與子宮平滑肌瘤相比，CKS2在子宮平滑肌肉瘤中的表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(p=0.000)。
　　2.統(tǒng)計結(jié)果顯示，CKS2高表達組的腫瘤體積更大(p=0.014)，孕激素受體的表

5、達水平下調(diào)(p=0.048)，CKS2的表達與患者年齡、FIGO分期、雌激素受體表達水平無明顯關(guān)系。
　　3.Kaplan—Meier分析顯示在子宮平滑肌肉瘤中CKS2高表達組的病人預(yù)后比低表達組差(Log Rank Chi-square=4.735，p＜0.05)。Cox比例風險模型多因素分析表明CKS2的過表達(Risk ratio，RR=3.124，p=0.036)和FIGO分期是子宮平滑肌肉瘤患者的獨立預(yù)后因子(Risk

6、ratio，RR=2.087，p=0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.在子宮平滑肌肉瘤和子宮平滑肌瘤中，CKS2主要定位于細胞核中。與子宮平滑肌瘤相比，CKS2在子宮平滑肌肉瘤中表達明顯上調(diào)。
　　2.在子宮平滑肌肉瘤中，CKS2高表達組的腫瘤體積更大，孕激素受體的表達下調(diào)，CKS2的高表達預(yù)示著較差的預(yù)后。CKS2的表達和FIGO分期是子宮平滑肌肉瘤患者的獨立預(yù)后因素。
　　第二部分 CKS2對子宮平滑肌肉瘤細

7、胞生物學行為的影響及其作用機制的研究
　　方法:
　　1.設(shè)計并合成CKS2特異性的的siRNA，以脂質(zhì)體為介導(dǎo)轉(zhuǎn)染子宮平滑肌肉瘤(ULMS)細胞株（SK-UT-1和SK-UT-1B），干擾CKS2基因的表達，并設(shè)立對照組。
　　2.轉(zhuǎn)染一定時間后收集試驗組和對照組腫瘤細胞，提取細胞中RNA及蛋白質(zhì)，分別利用RT-qPCR和western blot方法檢測CKS2基因的mRNA的表達情況和CKS2蛋白的表達情況，檢測C

8、KS2的干擾效率。
　　3.利用CCK8方法檢測實驗組和對照組0-96h ULMS細胞增殖情況并繪制細胞生長曲線。
　　4.檢測干擾CKS2后對ULMS細胞遷移和浸潤的影響:利用Transwell小室和鋪膠小室檢測試驗組和對照組中ULMS細胞遷移和浸潤情況。
　　5.檢測干擾CKS2對ULMS細胞平板克隆形成能力的影響:利用平板克隆形成實驗檢測試驗組和對照組中ULMS細胞平板克隆形成能力。
　　6.檢測干擾CKS

9、2對ULMS細胞周期的影響:將待測細胞用PI染色，利用流式細胞技術(shù)，檢測試驗組和對照組中腫瘤細胞周期情況，統(tǒng)計分析兩組的差異。
　　7.檢測干擾CKS2后對ULMS細胞凋亡的影響:將待測細胞用AnnexinV-FITC/PI雙染后，利用流式細胞技術(shù)，檢測試驗組和對照組中ULMS細胞凋亡情況，統(tǒng)計分析兩組的差異。
　　8.檢測干擾CKS2后對ULMS細胞中蛋白質(zhì)表達改變:利用western blot方法檢測試驗組和對照組中蛋白

10、表達水平，統(tǒng)計分析兩組的差異。
　　結(jié)果:
　　1.SK-UT-1和SK-UT-1B細胞在轉(zhuǎn)染sI-CKS2后，CKS2的mRNA和蛋白表達均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01，p＜0.05)。
　　2.細胞生長曲線結(jié)果表明，SK-UT-1和SK-UT-1B細胞分別在轉(zhuǎn)染si-CKS2后48h和24h后增殖能力出現(xiàn)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.SK-UT-1和SK-UT-1B細胞在轉(zhuǎn)染si-C

11、KS2后，細胞遷移及浸潤能力均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01，p＜0.01)。
　　4.SK-UT-1和SK-UT-1B細胞中，si-CKS2轉(zhuǎn)染組克隆形成數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01，p＜0.01)。
　　5.SK-UT-1和SK-UT-1B細胞在轉(zhuǎn)染si-CKS2后，G1期細胞比例上升，S期細胞比例下降，細胞被阻滯于G1期。
　　6.SK-UT-1和SK-UT-1B細胞在轉(zhuǎn)染si-CKS2后，

12、干擾組的細胞凋亡率與對照組相比無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　7.SK-UT-1和SK-UT-1B細胞在轉(zhuǎn)染si-CKS2后，cyclin A2表達下降，claudin1，p-AKT，p-ERK，p-P38和Bax無明顯改變。
　　結(jié)論:
　　1.CKS2在SK-UT-1和SK-UT-1B細胞株中均有表達。
　　2.CKS2可以促進ULMS細胞的增殖、遷移、浸潤和體外平板克隆的形成，促進ULM