LIT1基因印記狀態(tài)與大腸癌生物學行為的關系.pdf

1、目的：大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國是大腸癌發(fā)病率相對低的國家，近年來呈上升趨勢。有報道顯示，大腸癌的發(fā)病率已居惡性腫瘤的第三位，死亡率位列癌癥死因的第五位。研究發(fā)現(xiàn)與大腸癌發(fā)生發(fā)展相關的遺傳學改變有許多，如APC基因突變、k2ras、p53等。近年來腫瘤的表遺傳學改變逐漸受到人們的關注，所謂表遺傳是指基因序列沒有改變，但其表達發(fā)生了可遺傳性改變的現(xiàn)象。也就是說表遺傳的改變是發(fā)生在基因表達調控的水平上。基因組印記屬于表遺傳的范疇，它

2、是近年發(fā)現(xiàn)的一種不遵從孟德爾定律的依靠單親傳遞某些遺傳學性狀的現(xiàn)象，也就是某些基因呈親源依賴性的單等位基因表達，其另一等位基因不表達或表達極弱，仿佛這些基因的不同親本來源的一對等位基因上帶有某種可供識別的印記而故名，具有這種現(xiàn)象的基因稱為印記基因(Imprinted Gene)。LIT1(long QT introuc transcript1)是一種印記基因位于人染色體11p15.5，是由于KvLQT1基因的內含子有反義鏈的轉錄。KvL

3、QT1是一種負責編碼心肌鉀離子通道蛋白的基因，基因內的缺失和突變改變了蛋白質的氨基酸序列，進而影響鉀離子通道蛋白的功能，造成心肌細胞膜內外離子流的紊亂，使細胞復極時間延長，表現(xiàn)出LQTS的一系列癥狀。在許多組織中，LIT1母源基因表達，父源基因被印記而表達抑制。有研究認為印記機制破壞在腫瘤的發(fā)展中起著重要的作用。本研究組先前研究LIT1基因的印記丟失與BWS(巨大舌—臍膨出綜合征)發(fā)病有關。所謂的印記丟失(loss of imprint

4、ing，LOI)則是指特定親本來源的等位基因的正常表達方式的喪失。 本實驗采用逆轉錄—聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性(RT-PCR—RFLP)方法，研究大腸癌中LIT1基因的雜合丟失和印記狀態(tài)的改變及相互關系，分析印記基因LIT1與大腸癌的關系，探討LIT1在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的印記調控機制，并探討其與大腸癌生物學行為的關系。 方法： 一、實驗材料 1.實驗標本：收集57例人原發(fā)性大腸癌患者外科手術切除

5、的癌和遠癌組織標本，提取DNA和RNA。2.主要試劑藥品及儀器：瓊脂糖(美國Amresco)；DNA限制性內切酶(日本TAKARA)；TRIZOL(凱基)；RT-PCR試劑盒、Genefinder核酸染料購自日本TAKARA公司。引物、β—actin由上海生工提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。高壓滅菌器LS3020(SanYo)，酶連免疫檢測儀SUNRISE(TACAN)，低速離心機LM—2A(北京醫(yī)用離心機廠)，深凍冰箱FORMA SCI

6、ENTIFIC(美國)，電泳箱BCK—181A(HAIRE)，PCR擴增儀PTC—100TM(美國)，低溫臺式離心機ST—21型(SORVALL SURPER)，紫外分光光度計UV—260型(島津)，電泳儀DYY—Ⅲ5型(美國)，電泳凝膠成像自動分析系統(tǒng)OLYMPUS。電熱恒溫水浴箱HETW21600(上海躍進醫(yī)療器械廠)。 二、試驗方法 1.組織DNA/RNA提取和鑒定。取約100mg凍存組織標本，常規(guī)用10％SDS/

7、氯仿/乙醇法提取DNA。紫外分光光度法測定A260/A280，DNA樣品的比值為1.8—2.0為最佳。TRIZOL試劑/氯仿/異丙醇/乙醇提取RNA。 2.篩選雜合子標本。用用聚合酶鏈反應—限制性片斷長度多態(tài)性(PCR—RFLP)方法分析各個標本的基因型。當標本的基因型為雜合狀態(tài)時，才能為區(qū)分兩條等位基因的表達產(chǎn)物提供信息。LIT1—F，5’—CAgCACAAAgAggTTTTTgACAg—3’，LIT1—R，5’—gAgTTT

8、—AAAACACgTgTgTgCATT—3’，退火溫度54℃，產(chǎn)物片段為410 bp，由上海生工公司代為合成。在20μlPCR反應體系中，含10×PCR buffer2μl，50mM MgCl21μl，10mM dNTP0.4μl，10uM引物1.6ul，ddH2O14μl，TaqE0.2μl，DNA20μl。PCR反應條件為：94℃2min→(94℃30 s→54℃30 s→72℃1min)×30個循環(huán)→72℃5min。取PCR產(chǎn)物8

9、μl瓊脂糖凝膠電泳，酶切37℃水浴過夜，聚丙烯酰胺凝膠電泳，genefinder核酸染料染色，對雜合子進行篩選。 3.基因印記狀態(tài)檢測。選擇雜合子標本，對其RT-PCR產(chǎn)物用相同的內切酶切，酶切后經(jīng)12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果LIT1的基因表達呈雙等位基因表達型(AB型)即410bp、222bp和188bp同時存在，說明發(fā)生了印記丟失。如果呈單等位基因表達，即只有410bp(A型)或只有222bp和188bp(B型)，說

10、明轉錄來自于一條等位基因，即維持正常印記狀態(tài)(可能由于222bp與188bp片段相差較小，相互重疊，不能清楚顯示，故以222bp為酶切判斷標準)。 4.統(tǒng)計學處理。采用Fisher確切概率法分析LIT1印記丟失與臨床病理資料的相關性。所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進行分析。 結果：1.PCR產(chǎn)物檢測。以證實LIT1基因為410bp，通過對PCR反應液的瓊脂糖凝膠電泳后圖像分析，以成功合成產(chǎn)物。2.雜合標本的篩選。57例

11、待測標本中，共篩出9例LIT1雜合標本，其陽性率在大腸癌組織中為15.79％(9/57)。9個雜合的標本的腫瘤組織DNA全為雜合的，無雜合性丟失。3.印記狀態(tài)檢測。9個雜合標本的正常組織反轉錄的cDNA，經(jīng)PCR后，再經(jīng)RsaⅠ酶切后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，全為純合子標本。而印記丟失為4個標本(4/9=44.44％)。 結論：1.LIT1基因的LOI僅發(fā)生在大腸癌組織，癌旁組織無LOI。2.LIT1基因與臨床病理學特征(年齡，