LIT1基因印記狀態(tài)與大腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系.pdf

1、目的：大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)是大腸癌發(fā)病率相對(duì)低的國(guó)家，近年來(lái)呈上升趨勢(shì)。有報(bào)道顯示，大腸癌的發(fā)病率已居惡性腫瘤的第三位，死亡率位列癌癥死因的第五位。研究發(fā)現(xiàn)與大腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的遺傳學(xué)改變有許多，如APC基因突變、k2ras、p53等。近年來(lái)腫瘤的表遺傳學(xué)改變逐漸受到人們的關(guān)注，所謂表遺傳是指基因序列沒(méi)有改變，但其表達(dá)發(fā)生了可遺傳性改變的現(xiàn)象。也就是說(shuō)表遺傳的改變是發(fā)生在基因表達(dá)調(diào)控的水平上。基因組印記屬于表遺傳的范疇，它

2、是近年發(fā)現(xiàn)的一種不遵從孟德?tīng)柖傻囊揽繂斡H傳遞某些遺傳學(xué)性狀的現(xiàn)象，也就是某些基因呈親源依賴性的單等位基因表達(dá)，其另一等位基因不表達(dá)或表達(dá)極弱，仿佛這些基因的不同親本來(lái)源的一對(duì)等位基因上帶有某種可供識(shí)別的印記而故名，具有這種現(xiàn)象的基因稱為印記基因(Imprinted Gene)。LIT1(long QT introuc transcript1)是一種印記基因位于人染色體11p15.5，是由于KvLQT1基因的內(nèi)含子有反義鏈的轉(zhuǎn)錄。KvL

3、QT1是一種負(fù)責(zé)編碼心肌鉀離子通道蛋白的基因，基因內(nèi)的缺失和突變改變了蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進(jìn)而影響鉀離子通道蛋白的功能，造成心肌細(xì)胞膜內(nèi)外離子流的紊亂，使細(xì)胞復(fù)極時(shí)間延長(zhǎng)，表現(xiàn)出LQTS的一系列癥狀。在許多組織中，LIT1母源基因表達(dá)，父源基因被印記而表達(dá)抑制。有研究認(rèn)為印記機(jī)制破壞在腫瘤的發(fā)展中起著重要的作用。本研究組先前研究LIT1基因的印記丟失與BWS(巨大舌—臍膨出綜合征)發(fā)病有關(guān)。所謂的印記丟失(loss of imprint

4、ing，LOI)則是指特定親本來(lái)源的等位基因的正常表達(dá)方式的喪失。 本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RT-PCR—RFLP)方法，研究大腸癌中LIT1基因的雜合丟失和印記狀態(tài)的改變及相互關(guān)系，分析印記基因LIT1與大腸癌的關(guān)系，探討LIT1在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的印記調(diào)控機(jī)制，并探討其與大腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系。 方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1.實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：收集57例人原發(fā)性大腸癌患者外科手術(shù)切除

5、的癌和遠(yuǎn)癌組織標(biāo)本，提取DNA和RNA。2.主要試劑藥品及儀器：瓊脂糖(美國(guó)Amresco)；DNA限制性內(nèi)切酶(日本TAKARA)；TRIZOL(凱基)；RT-PCR試劑盒、Genefinder核酸染料購(gòu)自日本TAKARA公司。引物、β—actin由上海生工提供。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。高壓滅菌器LS3020(SanYo)，酶連免疫檢測(cè)儀SUNRISE(TACAN)，低速離心機(jī)LM—2A(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，深凍冰箱FORMA SCI

6、ENTIFIC(美國(guó))，電泳箱BCK—181A(HAIRE)，PCR擴(kuò)增儀PTC—100TM(美國(guó))，低溫臺(tái)式離心機(jī)ST—21型(SORVALL SURPER)，紫外分光光度計(jì)UV—260型(島津)，電泳儀DYY—Ⅲ5型(美國(guó))，電泳凝膠成像自動(dòng)分析系統(tǒng)OLYMPUS。電熱恒溫水浴箱HETW21600(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。 二、試驗(yàn)方法 1.組織DNA/RNA提取和鑒定。取約100mg凍存組織標(biāo)本，常規(guī)用10％SDS/

7、氯仿/乙醇法提取DNA。紫外分光光度法測(cè)定A260/A280，DNA樣品的比值為1.8—2.0為最佳。TRIZOL試劑/氯仿/異丙醇/乙醇提取RNA。 2.篩選雜合子標(biāo)本。用用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR—RFLP)方法分析各個(gè)標(biāo)本的基因型。當(dāng)標(biāo)本的基因型為雜合狀態(tài)時(shí)，才能為區(qū)分兩條等位基因的表達(dá)產(chǎn)物提供信息。LIT1—F，5’—CAgCACAAAgAggTTTTTgACAg—3’，LIT1—R，5’—gAgTTT

8、—AAAACACgTgTgTgCATT—3’，退火溫度54℃，產(chǎn)物片段為410 bp，由上海生工公司代為合成。在20μlPCR反應(yīng)體系中，含10×PCR buffer2μl，50mM MgCl21μl，10mM dNTP0.4μl，10uM引物1.6ul，ddH2O14μl，TaqE0.2μl，DNA20μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃2min→(94℃30 s→54℃30 s→72℃1min)×30個(gè)循環(huán)→72℃5min。取PCR產(chǎn)物8

9、μl瓊脂糖凝膠電泳，酶切37℃水浴過(guò)夜，聚丙烯酰胺凝膠電泳，genefinder核酸染料染色，對(duì)雜合子進(jìn)行篩選。 3.基因印記狀態(tài)檢測(cè)。選擇雜合子標(biāo)本，對(duì)其RT-PCR產(chǎn)物用相同的內(nèi)切酶切，酶切后經(jīng)12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，如果LIT1的基因表達(dá)呈雙等位基因表達(dá)型(AB型)即410bp、222bp和188bp同時(shí)存在，說(shuō)明發(fā)生了印記丟失。如果呈單等位基因表達(dá)，即只有410bp(A型)或只有222bp和188bp(B型)，說(shuō)

10、明轉(zhuǎn)錄來(lái)自于一條等位基因，即維持正常印記狀態(tài)(可能由于222bp與188bp片段相差較小，相互重疊，不能清楚顯示，故以222bp為酶切判斷標(biāo)準(zhǔn))。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Fisher確切概率法分析LIT1印記丟失與臨床病理資料的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：1.PCR產(chǎn)物檢測(cè)。以證實(shí)LIT1基因?yàn)?10bp，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)液的瓊脂糖凝膠電泳后圖像分析，以成功合成產(chǎn)物。2.雜合標(biāo)本的篩選。57例

11、待測(cè)標(biāo)本中，共篩出9例LIT1雜合標(biāo)本，其陽(yáng)性率在大腸癌組織中為15.79％(9/57)。9個(gè)雜合的標(biāo)本的腫瘤組織DNA全為雜合的，無(wú)雜合性丟失。3.印記狀態(tài)檢測(cè)。9個(gè)雜合標(biāo)本的正常組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA，經(jīng)PCR后，再經(jīng)RsaⅠ酶切后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，全為純合子標(biāo)本。而印記丟失為4個(gè)標(biāo)本(4/9=44.44％)。 結(jié)論：1.LIT1基因的LOI僅發(fā)生在大腸癌組織，癌旁組織無(wú)LOI。2.LIT1基因與臨床病理學(xué)特征(年齡，