曲古抑菌素A增強細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞株殺傷效果的體外研究.pdf

1、背景:
　　在我國，胰腺癌發(fā)病率逐年上升。根據(jù)統(tǒng)計，胰腺癌5年生存率低于5％，多數(shù)患者就診時已出現(xiàn)局部進(jìn)展，僅10％-15％患者可做到早期診斷，并行R0手術(shù)切除，完全R0切除者中位生存期為1.7年，無法切除的進(jìn)展期胰腺癌患者中位生存期為6個月，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的甚至不到3個月。目前，學(xué)術(shù)界認(rèn)為提高胰腺癌療效的出路在于綜合治療。細(xì)胞免疫治療代表的生物治療是胰腺癌綜合治療手段中的一個重要組成部分。細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞(cytokine i

2、nduced killer，CIK)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用具有高效和非MHC限制性的特點。CIK細(xì)胞具有與其它輔助治療措施協(xié)同效果良好，且具有殺瘤活性強，抗瘤譜廣，無明顯不良反應(yīng)、易實施個體化治療方案等優(yōu)點。但是不可樂觀的是，報道稱以100∶1靶效比(CIK細(xì)胞∶腫瘤細(xì)胞)進(jìn)行CIK細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞株ASPC-1的體外實驗中，殺傷率僅有51％。研究表明，在胰腺癌的進(jìn)展過程中，MICA/B-NKG2D介導(dǎo)的免疫監(jiān)視障礙起到了重要的推動作用。

3、具體來說，胰腺癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的降低是其免疫逃逸的主要機制之一。然而，有文獻(xiàn)報道曲古抑菌素A(TSA)可有效調(diào)高腫瘤細(xì)胞MICA/B的表達(dá)。由于胰腺癌細(xì)胞對于MICA/B分子的低表達(dá)，所以使用TSA調(diào)高患者腫瘤細(xì)胞表面的MICA/B受體表達(dá)，從而恢復(fù)并增強MICA/B-NKG2D介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，增強CIK細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞的殺傷活力和調(diào)整患者自身的免疫系統(tǒng)，可以成為胰腺癌的又一治療手段。
　　目的:
　　研究細(xì)胞因子誘

4、導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞株的殺傷效果;探索曲古抑菌素A(TSA)增強其殺傷效果的程度及機制。
　　方法:
　　1.分別使用PANC-1、BXPC-3、CFPAC-1胰腺癌細(xì)胞株進(jìn)行實驗。
　　2.將胰腺癌細(xì)胞株分別設(shè)定不加藥物組，曲古抑菌素A(TSA)加藥組。
　　3.TSA加藥組分為作用時間為24小時，但不同濃度(0、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L）;相同

5、濃度200nmol/L、不同作用時間（12小時、24小時、36小時、48小時）等隊列。使用PE標(biāo)記的MICA/B抗體標(biāo)記胰腺癌細(xì)胞株表達(dá)的MICA/B。
　　4.流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行測定PE標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)，計算表達(dá)陽性的細(xì)胞株百分比。從而找到TSA調(diào)高胰腺癌細(xì)胞株MICA/B表達(dá)的最佳濃度為200nmol/L，最佳作用時間為24小時。后續(xù)實驗使用最佳作用時間、最佳濃度進(jìn)行。
　　5.免疫熒光染色計數(shù)、Western bolt分別

6、測定經(jīng)過100nmol/L、200nmol/L、24小時的TSA作用后的胰腺癌細(xì)胞株膜型MICA/B表達(dá)，并與對照的不加藥物組進(jìn)行2組間比較。
　　6.乳酸脫氫酶釋放計量法測定CIK細(xì)胞∶腫瘤細(xì)胞=10∶1、CIK細(xì)胞∶腫瘤細(xì)胞=20∶1的2種比較貼近臨床實際治療濃度的情況下，CIK細(xì)胞對兩組胰腺癌細(xì)胞株的殺傷率。
　　7.使用統(tǒng)計學(xué)中的雙變量相關(guān)性分析來研究殺傷率與MICA/B的表達(dá)的關(guān)系是否成正比，從而找到調(diào)高M(jìn)ICA/

7、B的表達(dá)是否為殺傷率增高的原因。
　　結(jié)果:
　　1.使用流式細(xì)胞儀定量檢測的對照空白組BXPC-3、PANC-1、CFPAC-1的MICA/B表達(dá)陽性細(xì)胞率分別為61.2％、2.2％、31.2％。TSA加藥組:（200nmol/L、24小時），表達(dá)率分別86.6％，13.8％，76.1％(P＜0.01)。
　　2.免疫熒光染色顯示TSA加藥組的細(xì)胞染色明顯增強;Western bolt檢測TSA加藥組的胰腺癌細(xì)胞株M

8、ICA/B膜型蛋白表達(dá)增強。
　　3.在CIK細(xì)胞∶腫瘤細(xì)胞=10∶1的情況下，CIK細(xì)胞對對照組PANC-1、BXPC-3、CFPAC-1的殺傷率分別為7.66、12.03％，12.15％。TSA加藥組，CIK對以上3種細(xì)胞的殺傷率為24.32％，58.63％，49.25％，(P＜0.01)。CIK細(xì)胞∶腫瘤細(xì)胞=20∶1的情況下，TSA加藥組的殺傷率更加增高(P＜0.01)。
　　4.當(dāng)靶效比為CIK細(xì)胞∶腫瘤細(xì)胞=10