應(yīng)用小鼠ESCs體外誘導(dǎo)已分化體細(xì)胞為iPSCs的異性來源鑒別體系研究.pdf

1、將已經(jīng)分化的體細(xì)胞人工去分化生成多能性干細(xì)胞的方法稱為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPSCs)方法。其誘導(dǎo)過程經(jīng)歷了“體細(xì)胞的重編程”。應(yīng)用胚胎干細(xì)胞(ESCs)的裂解提取液也可以介導(dǎo)分化終端的體細(xì)胞發(fā)生“體細(xì)胞重編程”的過程，逆轉(zhuǎn)化體細(xì)胞為多能干細(xì)胞，這種iPSCs方法稱為細(xì)胞誘導(dǎo)法。這項(xiàng)技術(shù)是利用ESCs裂解液中豐富的多種轉(zhuǎn)化因子直接誘導(dǎo)體細(xì)胞內(nèi)與分裂增殖去分化相關(guān)基因的表達(dá)活性，在這個(gè)過程中既沒有ESCs基因組染色質(zhì)的直接參與，也沒有使體細(xì)

2、胞基因組的序列發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化，而只是重新激活了被誘導(dǎo)體細(xì)胞內(nèi)與干細(xì)胞性狀相關(guān)的基因，使其表達(dá)特性重新恢復(fù)到過去經(jīng)歷過的干細(xì)胞階段，這是真正意義上的、比較“生理化”的、自然性逆分化過程。與其它iPSCs技術(shù)比較，細(xì)胞間的直接誘導(dǎo)技術(shù)，能夠提高體細(xì)胞逆分化、重編程的效率，所生成多能干細(xì)胞的安全性強(qiáng)，具有重要的價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
　　 但是，這種體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)化體系中ESCs是直接參與者，被誘導(dǎo)的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)多能干細(xì)胞以后，這

3、種被誘導(dǎo)產(chǎn)生的干細(xì)胞的現(xiàn)狀和多種內(nèi)在的性狀都與誘導(dǎo)者相同或者相似，而且又是同時(shí)處于相同的生存環(huán)境中，在研究過程中要確定出現(xiàn)的多能干細(xì)胞的集落到底是來源于ESCs還是體細(xì)胞非常重要。因此，如何辨別多能干細(xì)胞來源是這個(gè)重編程體系的核心問題，直接關(guān)系到逆轉(zhuǎn)化的成功與否。本研究主要是利用與誘導(dǎo)體細(xì)胞不同性別來源的ESCs裂解提取液，建立小鼠ESCs體外誘導(dǎo)已分化體細(xì)胞為多能干細(xì)胞的異性來源鑒別體系，以解決體細(xì)胞重編程結(jié)果來源不明的問題，并在此基

4、礎(chǔ)上進(jìn)一步探討ESCs裂解提取液介導(dǎo)的MEFs重編程逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞的可能性及轉(zhuǎn)化效率。我們所建立的這種“異性來源鑒別體系”，方法簡單，鑒別結(jié)果可靠。首先，通過不同性別生殖嵴形態(tài)學(xué)差異鑒別出小鼠13.5天胚胎的性別，并分離培養(yǎng)出雌性MEFs;然后，利用PCR鑒定滋養(yǎng)層細(xì)胞的性別來分離培養(yǎng)出雄性ESCs;然后，在上述研究基礎(chǔ)上，使用雄性ESCs裂解提取液與雌性MEFs共孵育培養(yǎng)，誘導(dǎo)重編程體細(xì)胞為多能干細(xì)胞，通過檢測所得多能干細(xì)胞的性別

5、來確定其來源，建立小鼠ESCs體外誘導(dǎo)已分化體細(xì)胞為多能干細(xì)胞的異性來源鑒別體系，并且據(jù)此初步分析ESCs裂解提取液重編程體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。研究結(jié)果如下:
　　 實(shí)驗(yàn)一:不同性別MEFs的分離培養(yǎng)
　　 本研究利用妊娠13.5天雄性和雌性胎鼠的生殖嵴在形態(tài)學(xué)上存在明顯差異的特性，識別出不同性別昆明系小鼠胚胎，并分離培養(yǎng)出大量不同性別的MEFs，用于多能干細(xì)胞的異性來源鑒別體系研究。根據(jù)雄性小鼠特異性的Y染色體性別決定區(qū)（S

6、RY基因）的核心序列，設(shè)計(jì)一對引物，并對獲得的不同性別MEFs的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證不同性別胎鼠生殖嵴在形態(tài)學(xué)上存在的差異。結(jié)果表明PCR性別鑒定結(jié)果與MEFs來源胚胎的性別一致。不同性別的MEFs均具有典型的成纖維細(xì)胞特性，兩者在形態(tài)學(xué)上并沒有差異。因此，利用雄性與雌性胚胎在生殖嵴形態(tài)學(xué)上的差異可以快速分離獲得大量不同性別的MEFs，為多能干細(xì)胞的異性來源鑒別體系研究奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)二:小鼠ESCs的分離培養(yǎng)與

7、性別鑒定
　　 本研究采集妊娠4天昆明小鼠的囊胚進(jìn)行無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。3-5天后，選取明顯隆起呈柱狀的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行分離培養(yǎng)ESCs，同時(shí)分別對與分離ESCs的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來源一致的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行PCR性別鑒定。通過形態(tài)學(xué)觀察、AKP染色、Oct-4和SSEA-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色和EB三個(gè)胚層的標(biāo)志基因RT-PCR檢測進(jìn)行ESCs的鑒定。結(jié)果表明采集妊娠4天昆明小鼠的囊胚進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過滋養(yǎng)層細(xì)胞的PCR性別鑒定，可以成功分離培養(yǎng)出不同

8、性別的昆明小鼠ESCs，為多能干細(xì)胞的異性來源鑒別體系研究奠定基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)三:應(yīng)用小鼠ESCs裂解液重編程體細(xì)胞為iPSCs的異性來源鑒別體系研究
　　 本研究利用液氮反復(fù)凍融7次的方法制備小鼠雄性ESCs提取液，用最終濃度為25U/100μ L的SLO滲透化作用經(jīng)5-Aza-dC和TSA預(yù)處理雌性的MEFs，兩者共孵育培養(yǎng)1小時(shí)后，使用含有2mM CaCl2的ESCs培養(yǎng)液進(jìn)行封膜處理，然后在培養(yǎng)皿中制備成細(xì)胞懸

9、液的培養(yǎng)液滴進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，對得到的細(xì)胞集落通過形態(tài)學(xué)觀察、AKP染色、Oct-4免疫組化實(shí)驗(yàn)和分析多能性標(biāo)志基因的表達(dá)，鑒定重編程多能干細(xì)胞的性狀。最后，對得到的重編程多能干細(xì)胞，通過PCR性別鑒定的方法進(jìn)行來源的可靠性鑒定。結(jié)果表明小鼠雄性ESCs提取液可以成功誘導(dǎo)雌性MEFs重編程逆轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞，經(jīng)性別鑒定證實(shí)所得到的多能干細(xì)胞確實(shí)來源于雌性MEFs，從而證實(shí)了應(yīng)用小鼠ESCs體外誘導(dǎo)已分化體細(xì)胞為多能干細(xì)胞的異性來源鑒別體系的