小鼠ESCs在體外向PGCLCs定向誘導(dǎo)及其在體內(nèi)的卵巢再生研究.pdf

1、生殖系細胞的發(fā)生是目前生命科學(xué)研究的熱點課題，但是在哺乳動物中，生殖細胞發(fā)生、特化的具體時間和位置仍然是發(fā)育生物學(xué)界一直研究的難點。胚胎干細胞(ESCs)是全能性干細胞，已經(jīng)證明胚胎干細胞具有在體內(nèi)和體外向三個胚層分化及形成生殖嵌合體的能力，因此推測ESCs具有分化成卵母細胞的可能性。原生殖細胞來源于胚胎上胚層(epiblast)，是哺乳動物各級生殖細胞的祖細胞?，F(xiàn)已證明在體外可以將ESCs誘導(dǎo)為原生殖樣細胞(PGCLCs)，然后再誘導(dǎo)

2、成為具有受精能力的精子。但是，目前還沒有通過干細胞體外誘導(dǎo)與體內(nèi)卵巢再生結(jié)合的方法誘導(dǎo)獲得卵子的報道。
　　本研究以O(shè)ct4-GFP小鼠的ESCs為基本實驗材料，同時將mCherry基因轉(zhuǎn)入ESCs作為干細胞跟蹤標(biāo)記。首先利用小分子化合物ActivinA、bFGF、BMP4、BMP8a、SCF和EGF在體外誘導(dǎo)小鼠ESCs向上胚層樣細胞(EpiLCs)、原始生殖樣細胞(PGCLCs)定向分化，然后將帶有紅色熒光標(biāo)記的ESCs、Ep

3、iLCs、PGCLCs分別與12.5d雌性小鼠生殖腺細胞聚合兩天后移植到經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)處理后的卵巢ECM框架，進而移植到去卵巢的正常小鼠卵巢包膜內(nèi)，探討三種細胞對卵巢再生的影響。結(jié)果:(1)利用AP染色、免疫熒光染色、RT-PCR、q-PCR等實驗方法證明ESCs在向EpiLCs、PGCLCs的誘導(dǎo)過程中，在形態(tài)上、基因水平和蛋白質(zhì)水平上三種細胞分別符合ESCs、EpiSCs、PGCs的相應(yīng)形態(tài)、相應(yīng)基因表達、相應(yīng)蛋白質(zhì)表達

4、，說明ESCs在誘導(dǎo)過程中不僅維持了細胞的干細胞特異性，而且得到的ESCs、EpiLCs、PGCLCs是下一步實驗所理想的細胞材料。(2)12.5d雌性小鼠生殖腺細胞單獨，及其分別與ESCs、EpiLCs、PGCLCs三種細胞組合進行的卵巢再生實驗中，卵巢樣組織回收率分別為:67％(16/24)、75％(18/24)、0％(0/24)、100％(24/24)，PGCLCs組卵巢樣組織回收率最高。(3)在由ESCs和PGCLCs與12.5

5、d雌性小鼠生殖腺細胞組合形成的卵巢再生實驗中，均可觀察到正常卵巢結(jié)構(gòu)并檢測到表達紅色熒光的供體細胞，表明ESCs和PGCLCs移植到體內(nèi)后參與或促進了卵巢的再生;類似的，在EpiLCs與12.5d雌性小鼠生殖腺細胞組合形成的非卵巢結(jié)構(gòu)移植體中也檢測到了表達紅色熒光的標(biāo)記細胞，但是目前并沒有觀察到正常的卵巢結(jié)構(gòu)，我們推測EpiLCs對于卵巢再生具有一定的抑制作用。終上所述，本研究所用的ESCs在體外條件下可以定向誘導(dǎo)形成EpiLCs和PG