AFP158-166特異性T細(xì)胞的檢測(cè)及體外誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者外周血AFP158-166特異性T細(xì)胞比例，并利用健康志愿者外周血淋巴細(xì)胞，體外誘導(dǎo)AFP158-166特異性T細(xì)胞，為肝癌的免疫治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:1、采用FITC熒光標(biāo)記的HLA-A2抗體及HLA-A2基因分型高分辨檢測(cè)試劑盒(PCR-SSP)，篩選HLA-A0201患者。取外周血，密度梯度離心法分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群;通過(guò)R-PE標(biāo)記的MHC-AFP1

2、58-166肽五聚體，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)患者外周血中AFP158-166特異性T細(xì)胞的比例。
　　 2、篩選HLA-A0201的健康志愿者，分離PBMC，按如下兩種方法分別刺激特異性T細(xì)胞增殖。(1)培養(yǎng)T2雜交瘤細(xì)胞，負(fù)載HLA-A0201抗原表位肽AFP158-166，γ射線照射(75Gy)處理，與PBMC1∶1混合，反復(fù)刺激，IL-2維持。(2)以含人GM-CSF、IL-4及TNF-α細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)PMBC，貼壁粘附培

3、養(yǎng)法培養(yǎng)收獲樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，將DC負(fù)載HLA-A0201表位肽AFP158-166，與新鮮淋巴細(xì)胞以1∶10比例混合，含細(xì)胞因子IL-2培養(yǎng)液培養(yǎng)。待出現(xiàn)細(xì)胞大量增殖后收獲細(xì)胞，MHC-AFP158-166肽五聚體檢測(cè)AFP158-166特異性T細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷能力。
　　 結(jié)果:(1)28例肝細(xì)胞肝癌患者中，篩選出基因型HLA-A0201陽(yáng)性者18例，2ml外周血可分離PBMC約1(×)107個(gè)

4、，未能檢測(cè)出CD8+五聚體+T細(xì)胞。
　　 (2) T2細(xì)胞與AFP158-166共同孵育，細(xì)胞表面HLA-A2分子表達(dá)增加，隨著肽濃度增加，HLA-A2平均熒光強(qiáng)度及表達(dá)率逐漸增加，在抗原肽濃度為45μg/ml與60μg/ml時(shí)達(dá)到最大結(jié)合效力，90μg/ml時(shí)HLA-A2分子的表達(dá)下降。10例健康志愿者，基因型HLA-A0201陽(yáng)性者3例，每20ml外周血培養(yǎng)的細(xì)胞中可收獲DC細(xì)胞(1.94±0.79)×106個(gè)，培養(yǎng)至第7

5、天檢測(cè)表面抗原: CD83、CD80、CD86和HLA-DR陽(yáng)性率分別為（62.6±4.2）％、（90.4±2.4）％、（98.2±0.3）％和(87.9±4.2)％。
　　 (3)DC負(fù)載AFP158-166與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)14d左右出現(xiàn)大量細(xì)胞增殖，流式檢測(cè)CD8+MHC-AFP158-166五聚體+細(xì)胞7.5％，與負(fù)載AFP158-166的T2細(xì)胞混合培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中，未檢測(cè)到CD8+MHC-AFP158-166五聚體+

6、細(xì)胞。
　　 (3)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，DC激活的淋巴細(xì)胞對(duì)AFP+肝癌細(xì)胞HepG2和負(fù)載AFP的T2細(xì)胞的殺傷率顯著高于對(duì)未負(fù)載AFP的T2細(xì)胞和負(fù)載Her2抗原肽的T2細(xì)胞的殺傷率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)(效靶比20∶1時(shí)分別為45.12±10.60％和39.06±6.48％ vs14.83±9.82％和2.51±0.14％);T2激活的淋巴細(xì)胞依效靶比20∶1對(duì)上述細(xì)胞殺傷率分別為:HepG2(14.03±11

7、.17)％，負(fù)載AFP的T2(8.49±7.34)％，T2(3.26±0.32)％，負(fù)載Her2的T2(3.36±2.45)％，與DC激活的淋巴細(xì)胞對(duì)HepG2、負(fù)載AFP的T2細(xì)胞的殺傷作用比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:MHC-肽五聚體檢測(cè)未能從AFP+肝癌患者外周血中檢出AFP158-166特異性T淋巴細(xì)胞，提示患者免疫系統(tǒng)對(duì)AFP產(chǎn)生耐受或無(wú)能。DC負(fù)載抗原肽AFP158-166可體外刺激健康志愿