登革病毒GZ2002株全基因組測(cè)序及其對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞的感染性研究.pdf

1、登革病毒(Dengue virus，DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒。根據(jù)病毒抗原性不同將DENV分為4種血清型(DENV-1，2，3，4)，各型DENV感染均可引起人類(lèi)疾病，臨床上可表現(xiàn)為無(wú)癥狀、登革熱(Dengue fever，DF)和嚴(yán)重的登革出血熱及登革休克綜合癥(Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome，DHF/DSS)。我國(guó)的登革疾病流行以輸入性病例

2、引發(fā)當(dāng)?shù)亓餍袨橹鳎鄠€(gè)沿海省市均有過(guò)暴發(fā)流行，且主要集中在廣東省。近年來(lái)，隨著國(guó)際化和城市化發(fā)展，DENV感染范圍越來(lái)越大，感染人數(shù)明顯上升，新的毒株不斷出現(xiàn)。遺憾的是，目前對(duì)DHF/DSS的致病機(jī)理尚未闡明，因而嚴(yán)重影響了對(duì)DENV所致疾病防治手段的研究。
　　 全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)了解物種的起源，進(jìn)化和變異規(guī)律有著重要意義。目前已完成了上百株分離于不同時(shí)間，不同地點(diǎn)的DENV毒株的全基因組序列測(cè)定，這對(duì)探討DENV的起源，分子

3、進(jìn)化歷程及登革病的流行情況起到了重要的指導(dǎo)作用。此外，基于DENV全基因組的生物信息學(xué)分析可用于篩選DENV的毒力決定基因，可進(jìn)一步通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建DENV感染性克隆及其毒力決定位點(diǎn)突變體，為研究DENV蛋白功能，致病機(jī)制及新型減毒疫苗提供新思路。
　　 隨著對(duì)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)了人群的基因背景也作為重要因素決定著DENV感染后病情轉(zhuǎn)歸，特別是某些免疫應(yīng)答相關(guān)分子的基因位點(diǎn)多態(tài)性能直接通過(guò)調(diào)控人體免疫系統(tǒng)從

4、而影響DENV對(duì)特定人群的感染。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DCs)作為人體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen prosenting cells，APCs)參與組成了人體抵抗外界侵害的首要免疫屏障，也是DENV入侵機(jī)體的首要靶細(xì)胞。DC-SIGN(Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule3(ICAM-3)-grabbingnon-integrin，DC

5、-SIGN)是表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞表面的一類(lèi)重要的C-型凝集素受體，DENV入侵人體后首先通過(guò)E蛋白上的N-糖基化位點(diǎn)與DC-SIGN結(jié)合進(jìn)而感染人DCs。已證實(shí)，DC-SIGN編碼基因CD209位點(diǎn)多態(tài)性-336A/G對(duì)DENV的感染轉(zhuǎn)歸有重要影響。
　　 本教研室于2002年廣州DENV-1型病毒暴發(fā)流行期間自一名DENV特異IgM抗體陽(yáng)性的DF患者血清中分離得到DENV-1型毒株，命名為G22002株。經(jīng)乳鼠顱腦接種實(shí)驗(yàn)確定其

6、毒力后，C6/36細(xì)胞傳代后凍存于-80℃。本研究對(duì)DENV GZ2002株進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定及進(jìn)化分析，通過(guò)與3株不同毒力DENV-1型毒株的多序列比對(duì)，編碼區(qū)/非編碼區(qū)序列的差異分析，了解了其可能的毒力相關(guān)位點(diǎn)，并初步構(gòu)建了GZ2002株的感染性克隆。另一方面，本研究收集了700例健康人外周血標(biāo)本，確定了其中203例標(biāo)本DC-SIGN編碼基因CD209-139位(G/A)及-336位(A/G)的雙位點(diǎn)多態(tài)性，并進(jìn)一步驗(yàn)證了G22

7、002株對(duì)人DCs(CD209，-139A/-336A)的感染性。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.GZ2002株的全基因組測(cè)序
　　 用C6/36細(xì)胞常規(guī)增殖GZ2002株，待出現(xiàn)典型CPE后收集感染細(xì)胞及病毒液，提取RNA。根據(jù)NCBI公布的5株同源性較高的DENV-1型標(biāo)準(zhǔn)株AY145123、FJ176780、FJ176779、DVU88536、EF025110全序列設(shè)計(jì)了6對(duì)相互覆蓋的引物。采用分段式

8、RT-PCR法擴(kuò)增覆蓋GZ2002株基因組全長(zhǎng)的6個(gè)cDNA片段，并將其分別克隆到pMD-18T載體上，通過(guò)序列測(cè)定和重疊序列拼接獲得全基因組序列。將測(cè)得的序列用DNAstar軟件進(jìn)行分析整理后得到完整的全基因組序列，并將注釋后的全基因組序列用Sequin軟件提交給GenBank，獲得登錄號(hào)：JN205310。
　　 2.GZ2002株全基因組序列的生物信息學(xué)分析
　　 GZ2002株基因組全長(zhǎng)10735 nt，單一閱讀

9、框長(zhǎng)10176 nt，推測(cè)編碼3392個(gè)氨基酸，5'及3'-UTR分別為94 nt和462 nt?；?4株來(lái)源于國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)，不同時(shí)間的DENV1-4型流行株全序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示GZ2002株屬于DENV-1型基因Ⅳ型，可能與1998年印度尼西亞DENV-1流行株相關(guān)。G22002株與DENV-2，3，4型及DENV-1型其他基因型之間無(wú)顯著的密碼子偏嗜性。比較強(qiáng)毒力株泰國(guó)16007株，次強(qiáng)毒力株柬埔寨株及弱毒力株印度尼西亞9

10、8901530株的基因組編碼區(qū)進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，隨DENV毒株致病力的增強(qiáng)，編碼區(qū)特異氨基酸突變位點(diǎn)明顯增多。3種毒力株的5'-UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守，而泰國(guó)16007株與柬埔寨株的3'-UTR存在高突變區(qū)。編碼區(qū)的氨基酸差異及3'-UTR的高變區(qū)可能是重要的毒力相關(guān)位點(diǎn)，其生物學(xué)意義值得進(jìn)一步探討。
　　 3.初步構(gòu)建了GZ2002株全長(zhǎng)感染性克隆
　　 大片段的克隆存在一定的技術(shù)難度，GZ2002株的感染性克隆構(gòu)建選用裝載量

11、較大的pFastBac-HTA質(zhì)粒，并根據(jù)載體和GZ2002株序列特征，設(shè)計(jì)了3對(duì)克隆引物。目前已將GZ2002株的全基因序列擴(kuò)增為3個(gè)大片段(pFast1，pFast2，pFast3)，分別克隆至測(cè)序載體pMD-18T上，并分別進(jìn)行了核苷酸測(cè)序驗(yàn)證?，F(xiàn)pFast2已成功連入pFastBac-HTA載體中，pFast1和pFast3的插入尚待后續(xù)的努力。
　　 4.人群中存在多種CD209-139位(G/A)及-336位(A/G

12、)多態(tài)性組合。
　　 根據(jù)NCBI公布的人DCs上DC-SIGN編碼基因CD209序列設(shè)計(jì)引物right28和423，其擴(kuò)增產(chǎn)物包含CD209的-139位及-336位。從某大型醫(yī)院收集700例健康人的外周血提取全血基因組，獲得有效DNA樣本605例(另95例樣本DNA提取不理想，故舍去)。用right28和423進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物(約457bp)。SpeI酶切鑒定了605例樣本-139位多態(tài)性，結(jié)果顯示-139位A

13、者有280例，-139位G有86例，-139位為AG雜合子有239例。采用錯(cuò)配PCR方法確定了203例樣本-336位多態(tài)性分布(-336位A為154例，-336位G為6例，-336位AG雜合子為43例)。結(jié)合100例測(cè)序結(jié)果確定了203例樣本-139位和-336位的雙位點(diǎn)多態(tài)性分布。分析發(fā)現(xiàn)，203例樣本中，CD209-139A/-336A為最主要的多態(tài)性組合，占36.5%，其次是CD209-139AG雜合子/-336A，占30%，其余

14、組合所占的比例均在10%以下(具體結(jié)果見(jiàn)下表)。
　　 5.人外周血DCs的培養(yǎng)與鑒定
　　 抽取健康人外周血30ml，聚蔗糖.泛影葡胺密度梯度離心，提取外周血單核細(xì)胞(PBMC)后，通過(guò)反復(fù)貼壁及細(xì)胞因子(GM-CSF，IL-4)誘導(dǎo)獲得人DCs，并應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征、特異標(biāo)志CD1a的流式細(xì)胞儀檢測(cè)和混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，按上述方法，約7d后可獲得半懸浮的DCs。顯微鏡下觀察可見(jiàn)DCs體積較大，形態(tài)不規(guī)

15、則，表面有大量樹(shù)枝狀突起；瑞氏染色后鏡下觀察可見(jiàn)DCs呈墨藍(lán)色，核深染，邊界有毛刺樣突起；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其特異性標(biāo)志CDal陽(yáng)性表達(dá)率約為91%；MTT混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)的DCs具有較強(qiáng)的刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力。
　　 6.GZ2002株對(duì)人DCs(CD209，-139A/-336A)的感染性
　　 用GZ2002株對(duì)人DCs(CD209，-139A/-336A)進(jìn)行感染。感染3d后收集感染細(xì)胞進(jìn)行CD1a，

16、HLA-DR，CD86細(xì)胞標(biāo)志流式檢測(cè)及形態(tài)觀察。瑞氏染色顯示，與未感染的對(duì)照細(xì)胞相比，感染后的DCs形態(tài)明顯變圓，刺突變短；CD1a、CD83、HLA-DR的表達(dá)量明顯變化：CD1a(感染前66.9%→感染后94.8%)，HLA-DR(感染前34.6%→感染后77.4%)，CD83(感染前14.9%→感染后66.8%)；收集GZ2002株感染人DCs(CD209，-139A/-336A)的上清感染Vero細(xì)胞，進(jìn)行DENV特異E蛋白和