類鼻疽伯克霍爾德菌全基因組測序及感染細(xì)胞模型的建立.pdf

1、類鼻疽伯克霍爾德菌(B.pseudomallei)是一種革蘭氏陰性桿菌,1911年首次在緬甸仰光分離到,運動活躍,可以通過氣溶膠的形式傳播。根據(jù)能否利用L-阿拉伯糖可以將其分為致病性和非致病性,不能利用L-阿拉伯糖的為致病性菌株。2006年美國CDC將其列為B類病原體,“9.11”之后美國更視其為生物恐怖劑。類鼻疽伯克霍爾德菌能導(dǎo)致一種危害嚴(yán)重的熱帶疾病,稱為類鼻疽,臨床表現(xiàn)為多發(fā)性膿腫,難治性肺炎和致死性的敗血癥,死亡率可達40％。我

2、國海南、廣東、廣西和臺灣等地都是類鼻疽的疫源地。隨著地區(qū)輸入性病例的增多,該病原體越來越受到重視,但在中國類鼻疽的研究還亟待加強。
　　開展類鼻疽的研究首先需要具有參考價值的標(biāo)準(zhǔn)株,但是由于涉及生物安全和生物威脅,難于直接從國外獲取標(biāo)準(zhǔn)菌株?；蚪M測序是了解細(xì)菌遺傳背景的最本質(zhì)的方法。為此本研究篩選了一株臨床B.pseudomallei進行全基因組測序并進一步分析其基因組的特點,以形成我國B.pseudomallei標(biāo)準(zhǔn)株。

3、>　　同時,建立B.pseudomallei感染細(xì)胞模型是研究細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的前提。本研究擬以完成測序的B.pseudomalleiBPC006為感染細(xì)菌,通過優(yōu)化B.pseudomallei感染RAW264.7的各項參數(shù),觀察細(xì)胞受B.pseudomallei感染后細(xì)胞形態(tài)的特殊變化,檢測宿主細(xì)胞的生化和免疫學(xué)指標(biāo),以期建立穩(wěn)定的B.pseudomallei感染細(xì)胞模型。
　　方法
　　1.采用454測序儀對一株來

4、自我國海南的B.pseudomalleiBPC006進行全基因組測序。調(diào)用Newbler2.3軟件、比照參考株B.pseudomalleistrain1106a進行參考拼接,PCR、ABI3730測序儀補全漏洞(gap)后進行在線注釋、糾錯、提交、分析。
　　2.分別制備B.pseudomalleiBPC006全菌超聲抗原、甲醛滅活全菌抗原及熱滅活全菌抗原,免疫BALB/c小鼠和家兔,制備其多抗血清。
　　3.通過透射電鏡和

5、熒光標(biāo)記觀察胞內(nèi)細(xì)菌確認(rèn)B.pseudomallei胞內(nèi)感染,Giemsa染色和倒置顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞融合和多核巨細(xì)胞(multinucleatedgiantcells,MNGC)形成規(guī)律,計算侵襲率和檢測促炎癥因子,評價模型穩(wěn)定性。
　　結(jié)果
　　1.完成了B.pseudomalleiBPC006的全基因組序列測定,其序列號為:CP003781(1號染色體)和CP003782(2號染色體),分析發(fā)現(xiàn)其基因組中有溶源性大片段

6、的插入、缺失和突變,構(gòu)建類鼻疽伯克霍爾德菌的系統(tǒng)發(fā)生樹。
　　2.B.pseudomalleiBPC006全菌免疫BALB/c小鼠和兔,ELISA和凝集效價高達1:64000和1:128,免疫熒光顯示制備的抗體能與胞內(nèi)B.pseudomalleiBPC006菌體發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)。
　　3.MOI=100時B.pseudomallei感染RAW264.7細(xì)胞,細(xì)菌在胞內(nèi)繁殖后促使細(xì)胞間發(fā)生融合,可見明顯的MNGC形成,1

7、~24h炎癥因子TNF-α呈“雙峰”變化。
　　結(jié)論
　　1.首次對中國B.pseudomallei臨床分離株進行了全基因組測序,建立了B.pseudomallei研究的標(biāo)準(zhǔn)株,得到了臨床分離株B.pseudomalleiBPC006的全序列,分析其遺傳特點,為后續(xù)的類鼻疽流行病學(xué)調(diào)查、診斷及預(yù)防靶點的篩選提供了依據(jù)。
　　2.制備了針對B.pseudomalleiBPC006全菌的多抗血清,為后續(xù)病原體的診斷和細(xì)胞微