沙門氏菌全基因組測序分析及其DNA等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立和應(yīng)用研究.pdf

1、沙門氏菌是引發(fā)全球性的食源性疾病的主要致病菌之一，世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization，WHO)已經(jīng)將其列為具有中等危害和嚴(yán)重危害的食物傳播性病原。蛋及其制品、蔬菜、肉類等均是沙門氏菌重要的傳播途徑。在2500多種沙門氏菌血清型中，腸炎沙門氏菌（Salmonella ser.Enteritidis）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella ser.Typhimurium）及海德爾堡沙門氏菌（Salmonella

2、ser.Heidelberg）是常見的3種致病血清型。因此，建立快速、有效的檢測方法對上述血清型沙門氏菌進(jìn)行檢測，將在食品安全保障、公共衛(wèi)生監(jiān)測以及禽病預(yù)防和控制中發(fā)揮巨大作用。另外，沙門氏菌耐藥性的不斷增強(qiáng)一直以來也是備受關(guān)注的全球性問題，通過對耐藥性的監(jiān)測，不僅對防控沙門氏菌疫情暴發(fā)及合理使用抗生素提供科學(xué)依據(jù)，也為建立相關(guān)法律法規(guī)提供數(shù)據(jù)支持。近年來，全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)技術(shù)發(fā)展迅

3、速，尤其是在對食源性疫情暴發(fā)的檢測和監(jiān)控方面，起了至關(guān)重要的作用。全基因組測序技術(shù)在不久的將來在食品安全方面將發(fā)揮非常重要的作用。在眾多沙門氏菌檢測方法中，real-time PCR等分子生物學(xué)方法得到了廣泛的應(yīng)用，但是這些方法仍較耗時(shí)，且技術(shù)要求和檢測成本均較高，仍有很大的完善空間。DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，尤其是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LA MP)技術(shù)，以其特異性強(qiáng)、靈

4、敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)在眾多領(lǐng)域的微生物病原體檢測方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。
　　首先，本研究將通過對147株分離自蛋及其制品和雞肉中的沙門氏菌進(jìn)行全基因組測序分析，從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹、單核苷酸多態(tài)性及耐藥基因分析等方面對3種常見血清型沙門氏菌（腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌及海德爾堡沙門氏菌）進(jìn)行較為全面系統(tǒng)的對比分析，為沙門氏菌監(jiān)控及流行病學(xué)調(diào)研等工作提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。其次，首次對腸炎沙門氏菌的2種特異性檢

5、測目的基因prot6E和sefA基因的DNA序列及其產(chǎn)物蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析，為腸炎沙門氏菌檢測方法的建立提供理論基礎(chǔ)。再次，首次應(yīng)用GenieⅢ系統(tǒng)分別建立腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌LAMP方法分別對食品中的腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行特異性檢測，為食品及其所在環(huán)境中的沙門氏菌的檢測及監(jiān)測提供強(qiáng)有力的工具。另外，本研究以美國食品藥品監(jiān)督局(U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)細(xì)菌學(xué)分析手冊(

6、Bacteriological Analytical Manual，BAM)標(biāo)準(zhǔn)方法為參照，首次對新型等溫?cái)U(kuò)增儀器3MMolecular Detection System(MDS)、ANSR Pathogen Detection Syste(PDS)和GenieⅢ檢測沙門氏菌的效果進(jìn)行評估，并與real-time PCR檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，為上述及相關(guān)檢測系統(tǒng)的選擇、使用、評估及新檢測系統(tǒng)的研發(fā)等提供支持。
　　目前，國內(nèi)外傳統(tǒng)

7、檢測方法種分離沙門氏菌所選用的增菌液和培養(yǎng)基種類繁多，且各種增菌液和培養(yǎng)基的分離效果的比較研究甚少。因此，本研通過對3M MDS和ANSR PDS儀器推薦的非選擇性增菌液（蛋白胨緩沖液;buffered peptone water，BPW）與FDA BAM推薦使用的非選擇性增菌液（乳糖肉湯;lactose broth，LB）在增菌培養(yǎng)中的作用進(jìn)行了比較研究，并應(yīng)用該兩種方法對非選擇性增菌(pre-enrichment)和選擇性增菌(en

8、richment)后的樣品進(jìn)行檢測，并將結(jié)果與FDA BAM的結(jié)果進(jìn)行對比分析，篩選出更適宜的增菌液。最后，本研究探究存儲溫度及時(shí)間對待檢樣品氯化鎂孔雀綠(Rappaport-Vassiliadis，RV)和連四硫酸鹽(Tetrathionate，TT)增菌液中沙門氏菌存活的影響，旨在為完善沙門氏菌的傳統(tǒng)榆測方法，新試劑的研發(fā)，政府部門建立相關(guān)法規(guī)及降低工業(yè)界檢測成本等方面提供理論和技術(shù)支持，進(jìn)而提高檢測及監(jiān)測食源性疾病爆發(fā)的能力，確保

9、食品安全。主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過對147株沙門氏菌全基因組測序結(jié)果進(jìn)行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏、鼠傷寒沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌菌株的進(jìn)化隨時(shí)間、地域、來源的不同呈現(xiàn)多樣性，且菌株間存在種間水平基因轉(zhuǎn)移。
　　2.通過全基因組測序，對147株腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌菌株攜帶的耐藥基因進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)不同血清型及不同來源的耐藥菌株攜帶耐藥基因不同。其中，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌耐藥菌

10、株攜帶的耐藥基因表型多于海德爾堡沙門氏菌，雞肉源性的沙門氏菌攜帶耐藥基因表型多于蛋及其制品。另外，腸炎沙門氏菌對氨基糖苷類的耐藥性非常普遍，鼠傷寒沙門氏菌主要抗氨基糖苷類、四環(huán)素類和（或）磺胺類抗生素，而海德爾堡沙門氏菌主要抗氨基糖苷類和磷酶素類抗生素。鼠傷寒沙門氏菌多重耐藥菌株的分離率高于腸炎沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌。此外，隨時(shí)間推移，沙門氏菌的耐藥率和耐藥譜均有不斷增加及拓寬趨勢。
　　3.對比分析68株腸炎沙門氏菌特異性基

11、因prot6E和sefA基因在菌株中的DNA序列及其產(chǎn)物蛋白結(jié)構(gòu)，上述2種基因歷經(jīng)長期進(jìn)化，仍具較高保守性。其中，發(fā)現(xiàn)prot6E基因存在2種非同義突變，但其突變前后蛋白結(jié)構(gòu)的差異十分微小。而sefA基因雖僅存在1種非同義突變，但其蛋白結(jié)構(gòu)的差異較為顯著。
　　4.成功建立了基于prot6E基因檢測腸炎沙門氏菌的LAMP方法。該方法應(yīng)用GenieⅢ檢測系統(tǒng)，耗時(shí)短、操作簡便、特異性強(qiáng)，且靈敏度高。應(yīng)用建立的LAMP方法對蛋制品進(jìn)行

12、檢測，結(jié)果表明，該方法適用于蛋制品中腸炎沙門氏菌的快速檢測。
　　5.應(yīng)用GenieⅢ成功建立了檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP方法。該方法特異性好，可將鼠傷寒沙門氏菌與腸炎沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌區(qū)別開來;反應(yīng)靈敏度高于real-timePCR100倍。應(yīng)用建立的LAMP方法對蛋制品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，該方法適用于蛋制品中鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測。
　　6.應(yīng)用傳統(tǒng)檢測方法、等溫?cái)U(kuò)增檢測系統(tǒng)(3M MDS、ANSR PDS、

13、GenieⅢ)和real-timePCR分別對沙門氏菌純培養(yǎng)物、蛋及蛋制品、綠葉蔬菜樣品中沙門氏菌進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3M MDS、ANSR PDS及GenieⅢ檢測系統(tǒng)均適用于沙門氏菌的快速檢測，且3M MDS準(zhǔn)確率最高。
　　7.對BPW和LB兩種增菌液的增菌效果比較發(fā)現(xiàn)，使用BPW增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)時(shí)，3MMDS和ANSR PDS的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測方法一致，應(yīng)用LB增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)后，兩種方法檢測出的陽性樣品數(shù)均少于傳

14、統(tǒng)檢測方法，但針對該兩種方法分別與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對比分析并未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對于3M MDS和ANSR PDS檢測系統(tǒng)檢測蛋制品中的沙門氏菌，BPW作為非選擇性增菌液要優(yōu)于LB。應(yīng)用3M MDS和ANSR PDS檢測RV和TT增菌樣品結(jié)果表明，選擇性增菌液RV優(yōu)于TT。
　　8.對136份蛋制品的RV和TT增菌后的樣品于4℃條件下保存，于0-60天內(nèi)選取不同時(shí)間分別進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RV增菌液保存的陽性樣品數(shù)未見變化，效果優(yōu)于TT增