沙門氏菌快速檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用及其耐藥性分析研究.pdf

1、本研究成功建立了沙門氏菌快速檢測(cè)體系，包括斑點(diǎn)免疫金滲濾法、免疫金試紙條法、PCR快速檢測(cè)法和熒光定量PCR檢測(cè)法，對(duì)一系列反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，并已應(yīng)用于日常檢測(cè)和廈門市畜禽產(chǎn)品中沙門氏菌污染狀況的調(diào)查，檢測(cè)時(shí)間從常規(guī)法的4-5天縮短為2天，大大加快了沙門氏菌的檢測(cè)速度。同時(shí)對(duì)分離的沙門氏菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和耐藥程度分析，以了解沙門氏菌當(dāng)前的耐藥情況，建立了多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)四環(huán)素二種耐藥基因，從分子水平了解沙

2、門氏菌的耐藥情況。現(xiàn)將所做工作如下： 1、沙門氏菌快速檢測(cè)試紙條的研制與應(yīng)用。應(yīng)用提純的兔抗沙門氏菌抗體包被硝酸纖維素膜檢測(cè)線，羊抗兔IgG包被對(duì)照線，然后用膠體金標(biāo)記純化的兔抗沙門氏菌抗體建立了檢測(cè)沙門氏菌的快速檢測(cè)試紙條。該法通過膠體金標(biāo)記兔抗沙門氏菌抗體直接顯色，陽(yáng)性者檢測(cè)線出現(xiàn)紅色線，整個(gè)試驗(yàn)過程僅需10～15min即可判斷結(jié)果。與大腸桿菌、枸櫞酸桿菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌等常見腸道菌不發(fā)生交叉反應(yīng)。與沙門氏菌的最低檢測(cè)

3、量為2.3x10<'5> cfu/ml，且檢測(cè)時(shí)間從國(guó)標(biāo)法的4～5天縮短到2天，并與國(guó)標(biāo)法的符合率達(dá)到100％。將試紙條4℃或37℃存放9個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果無差異。整個(gè)操作過程不到1分鐘，比斑點(diǎn)免疫金滲濾法更為簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀，肉眼即可判斷，且可以保存。非常適合廣大養(yǎng)殖戶、基層檢疫部門和突發(fā)中毒事件時(shí)使用。 2、斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)沙門氏菌的研制與應(yīng)用。首先將制備的兔抗沙門氏菌抗體用與之出現(xiàn)交叉反應(yīng)的大腸桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、

4、奇異變形桿菌和陰溝桿菌等進(jìn)行吸附，然后離心，取上清液用Protein A Sepharose TMCL-4B柱進(jìn)行純化，測(cè)的蛋白含量為3.84mg/mL。然后用膠體金標(biāo)記純化的兔抗沙門氏菌抗體，SPA(金黃色葡萄球菌A蛋白)包被硝酸纖維素膜作對(duì)照點(diǎn)，用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立直接檢測(cè)沙門氏菌的斑點(diǎn)免疫金滲濾法(DIGFA)檢測(cè)試紙盒。整個(gè)試驗(yàn)過程僅需10～15分鐘即可判斷結(jié)果，操作簡(jiǎn)單，無需特殊儀器設(shè)備，陽(yáng)性者出現(xiàn)紅色斑

5、點(diǎn)，結(jié)果易于判斷，與大腸桿菌、枸櫞酸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌等不發(fā)生交叉反應(yīng)。與沙門氏菌的最低檢測(cè)量為4.5x10<'6>cfu/mL，同時(shí)將該法與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)效果比較，檢測(cè)時(shí)間從4～5天縮短到2天，符合率達(dá)100％。將膠體金標(biāo)記的兔抗沙門氏菌抗體凍干粉4℃存放12個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果無差異。該方法非常適合基層普查使用。 3、沙門氏菌PCR快速檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用。根據(jù)沙門氏菌屬高度保守的菌毛fimY基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了用于

6、檢測(cè)沙門氏菌的PCR方法。對(duì)收集的A-F群標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離的60株沙門氏菌分離株和11種非沙門氏菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8％瓊脂糖電泳進(jìn)行觀察，結(jié)果所有沙門氏菌均擴(kuò)增出526bp的特異性條帶，而非沙門氏菌菌株未擴(kuò)增出任何條帶。通過電泳判定結(jié)果，該法可檢出擴(kuò)增體系中93cfu的沙門氏菌，還可檢出含3cfu沙門氏菌的樣品用BP預(yù)增菌或用MM增菌后的菌液。而且該試劑穩(wěn)定性良好，冷凍至少能保存12個(gè)月。說明該方法敏感性高、特異性強(qiáng)

7、、穩(wěn)定性好。采用直接菌體加入法、熱裂解、反復(fù)凍融、CTAB堿裂解法和柱式試劑盒提取法分別提取核酸模板，結(jié)果CTAB法效果最好，但操作煩瑣，而直接菌體加入法和熱裂解法可以達(dá)到和柱式試劑盒同樣的效果，且操作簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)、效果好，值得推廣應(yīng)用。本研究為沙門氏菌屬的檢測(cè)提供了簡(jiǎn)潔、敏感、特異的新方法。也可以作為斑點(diǎn)免疫金滲濾法和免疫金試紙條法的確認(rèn)方法。 4、沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用。根據(jù)沙門氏菌屬高度保守

8、的菌毛fimY基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和TaqMan探針，建立了用于檢測(cè)沙門氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，組裝成快速檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到4.5cfu，比常規(guī)PCR高100倍，而且穩(wěn)定性艮好，冷凍至少可以保存9個(gè)月，而與其它非沙門氏菌不存在交叉反應(yīng)。特別適合有條件的檢疫部門開展大量樣品的檢測(cè)。 5、沙門氏菌快速檢測(cè)系列方法的應(yīng)用。將建立的四種檢測(cè)方法用于廈門市畜禽產(chǎn)品中沙門氏菌污染情況的調(diào)查。通過近三

9、年調(diào)查，廈門市畜禽產(chǎn)品等沙門氏菌污染率為1.72％(81/4705)，其中超市銷售的畜禽產(chǎn)品總體狀況良好，污染率為0.43％(9/2350)。廈門地區(qū)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)部分豬場(chǎng)(26.7％)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的豬產(chǎn)品(9.33％)和現(xiàn)場(chǎng)屠宰的禽類(2.67％)以及原高崎肉聯(lián)廠屠宰生豬(10％)沙門氏菌污染較為嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)管理，特別應(yīng)加強(qiáng)消毒清潔工作。 6、多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌四環(huán)素二種耐藥基因方法的建立和應(yīng)用。根據(jù)質(zhì)粒pRT11和

10、質(zhì)粒pBR322中相應(yīng)的四環(huán)素耐藥基因-TetB和TetC的基因序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，建立了同時(shí)檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因TetB和TetC的多重PCR方法。通過對(duì)35株沙門氏菌臨床分離株的四環(huán)素耐藥性的檢測(cè)，結(jié)果表明所有沙門氏菌分離株均含TetC基因，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性符合率65.7％(23/35)，其中8株同時(shí)含有TetB基因，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性符合率100％，選取其中部分菌株擴(kuò)增出的TetB和TetC基因片段進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，所

11、測(cè)5株菌的TetB基因擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pRT11中的相應(yīng)序列有很高的同源性，均為99.7％，而相互之間的同源性為100％；所測(cè)14株菌的TetC基因擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pBR322中的相應(yīng)序列有很高的同源性，均為100％。證實(shí)沙門氏菌耐藥基因普遍存在，且同時(shí)含有TetB和TetC基因的菌株表現(xiàn)耐藥。建立多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因，簡(jiǎn)便快速、省時(shí)省財(cái)，特別適合于大量樣本的檢測(cè)，這對(duì)開展沙門氏菌四環(huán)素多種耐藥基因的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了有

12、效的檢測(cè)途徑。將建立的多重PCR方法用于檢測(cè)臨床分離的奇異變形桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌和綠膿桿菌，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因TetC也普遍存在上述細(xì)菌中，同時(shí)檢出TelB和TetC的概率也很高。說明所建立的方法可作為四環(huán)素耐藥基因檢測(cè)的通用方法。 7、對(duì)廈門市畜禽產(chǎn)品中分離的沙門氏菌分離株進(jìn)行了24種藥物敏感試驗(yàn)和五種抗生素的藥物耐受研究。采用24種常用藥敏試紙開展59株沙門氏菌分離株的耐藥情況分析，為養(yǎng)殖場(chǎng)合理用藥提供參考。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)

13、當(dāng)前沙門氏菌耐藥性越來越強(qiáng)，其中普遍對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素、青霉素、紅霉素、利福平、麥迪霉素、新生霉素、痢特靈和氯霉素等耐藥，有些菌株甚至對(duì)高效抗生素如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、先鋒V、頭孢拉定和環(huán)丙沙星出現(xiàn)耐藥。其中能耐受3～10種抗生素的菌株數(shù)為2、5、6、13、11、7、3和2，所占百分比為3.4、8.5、10.2、22.0、18.6、11.9、5.1和3.4，能耐受12、14和15種抗生素的菌株為1、5和4株，占1.7

14、％、8.5％和6.8％。其中從廈門地區(qū)生豬飼養(yǎng)戶分離的4株菌有3株能耐受15種抗生素，1株耐7種。同時(shí)還重點(diǎn)開展了51株分離株對(duì)鏈霉素、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素和磺胺等五種抗生素的藥物耐受研究，結(jié)果四環(huán)素耐藥超過16ug／ml的菌株達(dá)35株(占68.6％，35/51)，鏈霉素耐藥超過16ug/mI的菌株達(dá)23株(45.1％，23/51)、氨芐青霉素超過16ug/ml的菌株達(dá)14株(占27.5﹪,14/51)、氯霉素超過16ug/ml的