德?tīng)柋吧抽T菌CRISPRS分子分型及全基因組測(cè)序分析.pdf

1、德?tīng)柋吧抽T菌是重要的人獸共患病原菌，可引起人的全身性系統(tǒng)疾病，國(guó)內(nèi)外均有該菌在醫(yī)院內(nèi)引起嬰幼兒腹瀉疾病暴發(fā)的案例。美國(guó)CDC數(shù)據(jù)顯示德?tīng)柋吧抽T菌在豬肉生產(chǎn)鏈中的分離率逐漸趨于首位。德?tīng)柋吧抽T菌不僅可以引起豬的長(zhǎng)程感染，而且可以在豬的各臟器內(nèi)定植，同時(shí)又不會(huì)引起豬明顯的臨床癥狀，所以容易被人們忽略。最近研究發(fā)現(xiàn)德?tīng)柋吧抽T菌在蛋雞和雞肉中的分離率也呈逐漸上升趨勢(shì)，這對(duì)食品安全造成了新的威脅。因此，有必要對(duì)德?tīng)柋吧抽T菌進(jìn)行系統(tǒng)研究，從而為該菌

2、的防控提供科學(xué)支撐。
　　本研究以CRISPRS序列為基礎(chǔ)首次對(duì)德?tīng)柋吧抽T菌進(jìn)行基因分型。根據(jù)分型結(jié)果選取有代表性的兩株德?tīng)柋吧抽T菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，解讀德?tīng)柋吧抽T菌基因組的遺傳信息，分析其在基因組上的差異。
　　1.德?tīng)柋吧抽T菌CRISPRS分子分型
　　2015年5月至2016年4月，對(duì)揚(yáng)州市T和S兩個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豬肉樣品進(jìn)行沙門菌流行病學(xué)調(diào)查。共進(jìn)行4次采樣，采集151份豬肉樣品，分離得到沙門菌84株，陽(yáng)性率為55.

3、6％。不同批次（春季、夏季、秋季、冬季）樣品沙門菌分離率波動(dòng)較大，從45.6％-75.0％不等。T市場(chǎng)沙門菌的分離率為65.7％，S市場(chǎng)沙門菌的分離率為47.6％，二者具有顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)84株沙門菌分離株進(jìn)行血清型鑒定，共鑒定出14種血清型，其中德?tīng)柋吧抽T菌24株，占總數(shù)的28.6％，為優(yōu)勢(shì)血清型，其余主要血清型還包括羅森沙門菌15株(17.9％)、鴨沙門菌11株(13.1％)、明斯特沙門菌10株(11.9％)、鼠傷寒沙

4、門菌9株(10.7％)。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期檢測(cè)了生豬、豬肉、腹瀉病人、雞肉、犬及鵝樣品中沙門菌，共分離出德?tīng)柋吧抽T菌376株，結(jié)合本次分離到的24株德?tīng)柋吧抽T菌共400株進(jìn)行CRISPRS分型研究。通過(guò)對(duì)CRISPRS基因位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，德?tīng)柋吧抽T菌均含有2個(gè)CRISPRS位點(diǎn)，即CRISPR1和CRISPR2，共101種間隔序列。CRISPR1中共檢出62種不同的間隔序列，其中18種是新發(fā)現(xiàn)間隔序列;CRISPR2中共檢出39種不

5、同的間隔序列，其中17種為新發(fā)現(xiàn)間隔序列;CRISPR1位點(diǎn)間隔序列數(shù)量要多于CRISPR2位點(diǎn)間隔序列，其多態(tài)性也高于CRISPR2位點(diǎn)。根據(jù)菌株間隔序列的分布，400株德?tīng)柋吧抽T菌被分為51種CRISPRS型(DCT)，其中以DCT24和DCT31型為最優(yōu)勢(shì)CRISPRS型，分別有110株和109株。通過(guò)對(duì)51種CRISPRS型進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的分析，51種CRISPRS型被分為L(zhǎng)1和L2兩個(gè)譜系，而這兩個(gè)譜系又被分為數(shù)個(gè)亞系。研究發(fā)現(xiàn)譜

6、系L1所有菌株MLST分型均為ST40，譜系L2所有菌株多位點(diǎn)序列分型結(jié)果均為ST71，從這兩個(gè)譜系CRISPRS位點(diǎn)間隔序列的分布來(lái)看只有2個(gè)相同的間隔序列，其余均不相同，表明這兩個(gè)譜系的菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能來(lái)源于不同的祖先。
　　來(lái)自揚(yáng)州地區(qū)屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及人源的264株德?tīng)柋吧抽T菌被分成了37種CRISPRS型，以DCT24和DCT31為優(yōu)勢(shì)CRISPRS型。屠宰場(chǎng)共有185株細(xì)菌被分為18種CRISPRS型，其下游農(nóng)貿(mào)

7、市場(chǎng)共73株細(xì)菌被分為28種CRISPRS型，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)菌株分型結(jié)果比屠宰場(chǎng)更具多樣性。人源株德?tīng)柋吧抽T菌CRISPRS型分別為DCT14、DCT20和DCT24型，間隔序列差異在5-14個(gè)之間，這三種CRISPRS型都包含屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及人三種來(lái)源菌株，這表明德?tīng)柋吧抽T菌可能在食物鏈中發(fā)生傳播。對(duì)淮安某屠宰場(chǎng)豬肉源德?tīng)柋吧抽T菌聚類比較分析結(jié)果顯示30株德?tīng)柋吧抽T菌被分為7種CRISPRS型，其之間的差異在1-9個(gè)間隔序列之間。三次樣品

8、菌株共享DCT24型，說(shuō)明在該屠宰場(chǎng)長(zhǎng)期存在此型的德?tīng)柋吧抽T菌。來(lái)自同一個(gè)屠宰環(huán)節(jié)的菌株卻屬于不同的CRISPRS型，這說(shuō)明在該屠宰場(chǎng)德?tīng)柋吧抽T菌菌株存在來(lái)源多樣化。在屠宰場(chǎng)同一批次不同環(huán)節(jié)中也存在相同的CRISPRS型，這說(shuō)明了德?tīng)柋吧抽T菌可能沿著屠宰鏈進(jìn)行傳播，因此每一屠宰環(huán)節(jié)都應(yīng)做好衛(wèi)生工作以防交叉污染。通過(guò)對(duì)9個(gè)地區(qū)豬場(chǎng)德?tīng)柋吧抽T菌進(jìn)行聚類分析，60株德?tīng)柋吧抽T菌被分成11種CRISPRS型，其間隔序列差異在1-22個(gè)不等，以D

9、CT24和DCT47為優(yōu)勢(shì)CRISPRS型。
　　綜上顯示CRISPRS分型方法能較好的將不同來(lái)源德?tīng)柋吧抽T菌進(jìn)行基因分型，并可根據(jù)間隔序列的種類、數(shù)量及分布位置來(lái)推測(cè)細(xì)菌的進(jìn)化特點(diǎn)，更直觀的看出菌株之間的差異。這在細(xì)菌分子流行病學(xué)調(diào)查中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
　　2.德?tīng)柋吧抽T菌R10和T12菌株生物學(xué)特性及全基因組測(cè)序分析研究
　　選取CRISRPS型譜系L1中的人源分離株R10，譜系L2中的豬肉源分離株T12進(jìn)行生

10、物學(xué)特性的研究。生化鑒定結(jié)果顯示R10菌株的L-乳酸鹽產(chǎn)堿(ILATK)為陰性，而T12菌株為陽(yáng)性，其余生化指標(biāo)均相同。R10菌株對(duì)四環(huán)素(TET)、復(fù)方新諾明(SXT)、鏈霉素(STR)、氯霉素(CHL)表現(xiàn)出耐藥性，而T12菌株對(duì)所有測(cè)定抗生素均敏感。R10菌株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的黏附力顯著低于T12菌株(P＜0.05)，R10菌株侵襲力極顯著低于T12菌株(P＜0.01)。R10菌株對(duì)豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2的黏附

11、和侵襲力均極顯著低于T12菌株(P＜0.01)。以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，測(cè)定兩個(gè)菌株LD50，R10菌株LD50為1.17×107 CFU，T12菌株為2.64×107 CFU，二者在毒力上無(wú)顯著性差異。
　　生物學(xué)特性研究顯示出二者具有較大差異，因此對(duì)R10和T12菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析。R10菌株基因組全長(zhǎng)為4，881，181 bp，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另有1個(gè)2834 bp的質(zhì)粒，GC含量為52.0％，編碼區(qū)GC含量為53

12、.2％。對(duì)R10基因組注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4678個(gè)蛋白編碼基因，編碼區(qū)占86.9％，另有107個(gè)結(jié)構(gòu)RNA基因(85個(gè)tRNA，22個(gè)rRNA其中8個(gè)5S rRNA，7個(gè)16SrRNA，7個(gè)23S rRNA)。T12菌株基因組全長(zhǎng)為4，920，869 bp，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，GC含量為52.1％，編碼區(qū)GC含量為53.2％。對(duì)T12基因組注釋有4755個(gè)蛋白編碼基因，編碼區(qū)占87.7％，另有106個(gè)結(jié)構(gòu)RNA基因（84個(gè)tRNA，22個(gè)rRNA其

13、中8個(gè)5S rRNA，7個(gè)16S rRNA，7個(gè)23SrRNA）。通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)R10菌株基因組上存在一個(gè)新的毒力島23(SPI-23)，約有36.4Kb，編碼36個(gè)基因，而T12菌株基因組上只含有SPI-23末端1個(gè)相對(duì)保守的docB基因。通過(guò)對(duì)基因組耐藥基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)，R10菌株比T12菌株多了7個(gè)耐藥基因，分別為aadA2，floR，F(xiàn)osA2，dfrA1，tetG以及兩個(gè)sul1基因，分別為鏈霉素、氯霉素、磷霉素、磺胺類抗菌增效

14、劑、四環(huán)素和復(fù)方新諾明耐藥基因，這與R10和T12菌株的耐藥表型相符合?；蚪M共線性分析顯示，R10和T12菌株共有4個(gè)共線性模塊(locallycolinear blocks，LCB)，而且基因組之間存在倒置現(xiàn)象（倒置區(qū)域有928 Kb），并且有部分插入或缺失，從基因組結(jié)構(gòu)來(lái)看兩株細(xì)菌差異較大。通過(guò)比較兩株細(xì)菌核苷酸序列發(fā)現(xiàn)共有四萬(wàn)多堿基差異，此結(jié)果說(shuō)明二者在基因組上有著巨大的差異，可能來(lái)自于不同的祖先。德?tīng)柋吧抽T菌全基因組測(cè)序分析的