利用RNAi技術(shù)培育抗花葉病毒轉(zhuǎn)基因羅漢果的研究.pdf

1、羅漢果花葉病毒嚴重影響羅漢果的產(chǎn)量，通過轉(zhuǎn)基因獲得抗病毒品種是防治羅漢果病毒病最有效的途徑，轉(zhuǎn)基因技術(shù)和RNAi技術(shù)的日漸成熟為培育抗花葉病毒轉(zhuǎn)基因羅漢果奠定了基礎。小西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchiniyellow mosaic virus, ZYMV）是羅漢果花葉病的主要病原病毒，分布較廣、危害較重。為了針對生產(chǎn)實踐中普遍發(fā)生的花葉病毒培育具有生產(chǎn)應用價值的抗病毒羅漢果品種，本研究以規(guī)模種植羅漢果基地的花葉病發(fā)病植株為基因克隆的實驗

2、材料。為了提高RNA干擾羅漢果花葉病毒復制的效率，把感染羅漢果的花葉病毒多個功能基因片段串聯(lián)起來作為RNAi目標片段，轉(zhuǎn)化羅漢果，從而建立一個穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用基因工程策略獲得對花葉病毒具有廣譜抗性的抗花葉病毒羅漢果植株。
　　本研究優(yōu)化了羅漢果組織培養(yǎng)擴繁的條件，最適外植體為莖尖，芽誘導培養(yǎng)基為 MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L，誘導率為97.5％；繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 mg/L+I

3、BA0.1 mg/L+GA30.1 mg/L，增殖率為9；通過葉片再生實驗結(jié)果表明：葉片誘導再生苗的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.5 mg/L+TDZ0.05 mg/L，出芽系數(shù)達10.68，為抗病毒羅漢果轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炋峁┏渥愕牟牧稀?br>　　本文研究了羅漢果組培苗的莖段、葉柄及葉片不同類型的外植體的再生能力，結(jié)果表明，葉片的再生率明顯高于葉柄和莖段，是羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化最佳外植體的選擇。同時對羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化的條件進行優(yōu)

4、化，研究結(jié)果表明：預培養(yǎng)1d、菌液濃度的OD值為0.2、外植體與農(nóng)桿菌侵染15 min、共培養(yǎng)4 d、抗生素羧芐霉素的濃度為200 mg/L、篩選劑G418濃度以40 mg/L作為篩選壓力的轉(zhuǎn)化率最高。
　　本研究將ZYMV的Hc-pro，NIa，NIb，CP基因和3?UTR區(qū)多個基因片段串聯(lián)構(gòu)成RNAi的目標序列，獲得的目的片段克隆到可以形成RNAi莖環(huán)結(jié)構(gòu)的中間載體pXQ中，形成RNAi結(jié)構(gòu)片段。通過PCR鑒定陽性克隆，最終獲