雞精原細(xì)胞分離純化與體外初步培養(yǎng).pdf

1、本研究通過對不同時期雞胚睪丸組織，以不同的酶組合方式以及不同的消化步驟分離獲取精原細(xì)胞，以期獲得最佳的酶消化組合和最適宜的雞精原細(xì)胞提取時間；同時在前期確定的分離方法基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用percoll梯度離心，并結(jié)合睪丸細(xì)胞不同的貼壁速度進(jìn)行純化，為建立雞精原細(xì)胞的分離、純化探索適宜的途徑；此外，本研究還初步研究了雞精原細(xì)胞在有無飼養(yǎng)層和有無體細(xì)胞存在情況下體外生長特性，從而為雞精原細(xì)胞的體外長期培養(yǎng)、建系及體外研究精子發(fā)生和轉(zhuǎn)基因動物的生

2、產(chǎn)提供有價值的參考依據(jù)。結(jié)果總結(jié)如下幾點(diǎn)：1.分別采用“1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶”、“1mg/ml膠原酶+1.5mg/ml透明質(zhì)酸酶/0.25％胰蛋白酶”和“1mg/ml膠原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶”三種方法消化雞睪丸組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雞睪丸組織經(jīng)“1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶”消化處理后，獲得的細(xì)胞活率(94.4％)和每睪活細(xì)胞數(shù)(3.24×105)比經(jīng)“1mg/ml膠

3、原酶+1.5mg/ml透明質(zhì)酸酶/0.25％胰蛋白酶”和“1mg/ml膠原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶”的處理分別高3.8％，1.04×105和5.1％，0.44×105；當(dāng)從孵化15d、19d雞胚和出雛后6d、13d公雞睪丸組織中分離精原細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，出雛后6d左右公雞獲得的精原細(xì)胞數(shù)約為33.8％，比孵化15d、19d雞胚和出雛后13d公雞分別高2.6％、4.3％和3.1％。結(jié)果表明：以“1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.2

4、5％胰蛋白酶”的二酶三步消化法分離出雛后6d公雞的睪丸組織能獲得較高的細(xì)胞活率和較多的每睪活細(xì)胞數(shù)與精原細(xì)胞數(shù)。 2.雞睪丸組織經(jīng)酶消化處理后，獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)一步經(jīng)percoll密度梯度離心和體外貼壁培養(yǎng)純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞懸液經(jīng)percoll梯度分選后，精原細(xì)胞主要位于19％～35％梯度層中，純度平均達(dá)到66.4％，再進(jìn)一步貼壁培養(yǎng)純化后精原細(xì)胞純度則可達(dá)82％，比未經(jīng)貼壁純化的精原細(xì)胞純度高出15.6％。說明以percol

5、l梯度離心和體外貼壁培養(yǎng)純化雞精原細(xì)胞，能獲得較高的精原細(xì)胞純度。 3.本研究分別比較了percoll分離前、后精原細(xì)胞在有、無飼養(yǎng)層條件下的培養(yǎng)情況，結(jié)果顯示：①在有飼養(yǎng)層條件下，未經(jīng)percoll分離的精原細(xì)胞懸液體外培養(yǎng)5h后，精原細(xì)胞開始貼壁；接種24h后，貼壁的體細(xì)胞已鋪展成不規(guī)則形狀，而貼壁的精原細(xì)胞仍呈圓形。接種48h后，精原細(xì)胞開始緩慢增殖，培養(yǎng)體系中多個一串或一團(tuán)的精原細(xì)胞顯著增多；接種96h后，少數(shù)精原細(xì)胞逐

6、漸脫離支持細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞，隨換液而被棄去。培養(yǎng)1周之后，精原細(xì)胞開始緩慢的退化，但數(shù)量卻沒有明顯的減少，在體系中維持著動態(tài)的平衡。②無飼養(yǎng)層條件下，睪丸細(xì)胞懸液接種6h左右，少數(shù)精原細(xì)胞開始貼壁；培養(yǎng)24h后，貼壁的支持細(xì)胞已開始鋪展成不規(guī)則形狀，精原細(xì)胞仍呈圓形散在地鑲嵌于支持細(xì)胞層之上；培養(yǎng)48h后，已有兩個一串的精原細(xì)胞出現(xiàn)，但數(shù)量較少；培養(yǎng)72h后，2個或多個一串的精原細(xì)胞開始增多，但同時游離的精原細(xì)胞也增多；培養(yǎng)5d，大部分