自然殺傷細胞分離純化及體外擴增技術體系的研究.pdf

1、[目的]
　　 探索建立擴增效率和目標細胞純度均較高的NK細胞體外分離及擴增技術體系，為NK細胞抗腫瘤機制研究及臨床免疫過繼治療提供方法學基礎。
　　 [方法]
　　 應用免疫磁珠陰性分選法從人外周血中分離高純度的CD3-CD56+CD16+NK細胞，純化的NK細胞于含10％人AB血清的造血干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴增18天，同時在培養(yǎng)體系中加入IL-2、IL-15、SCF不同細胞因子組合，每隔2天換液及補充細胞因子。

2、采用細胞計數(shù)法、流式細胞術免疫表型分析和CCK-8試劑盒檢測對K562細胞的殺傷率等方法比較不同培養(yǎng)體系對NK細胞增殖前后的數(shù)量、純度及殺傷活性的影響；并采取相同方法對IL-2的濃度與NK細胞增殖效率及殺傷活性之間的關系進行探討。
　　 [結果]
　　 1.經(jīng)免疫磁珠陰性分選后，CD3-CD56+CD16+NK細胞比例可由(12.70±2.66)％上升到(93.03±1.72)％，細胞存活率達98％，收獲細胞數(shù)量占分選前

3、PBMC的(11.71±1.45)％。在不同效靶比(1:1，5:1，10:1)下，經(jīng)分選后的CD3-CD56+CD16+NK細胞對K562細胞的殺傷率(％)是13.3±1.74，19.5±2.07，40.1±3.85，均顯著高于分選前PBMC對K562細胞的殺傷率(％)(3.9±1.08，7.9±1.56，11.3±1.75)(P<0.05)。
　　 2.純化的NK細胞在體外培養(yǎng)擴增18天，細胞存活率達93％。IL-2組、IL-

4、2+SCF組、IL-2+IL-15組和IL-2+IL-15+SCF組擴增倍數(shù)分別為13.09±3.84，22.11±3.58，39.15±5.11，46.15±4.26，均顯著高于空白對照組(4.85±1.39)(P<0.05)，各組間比較差異存在顯著性(P<0.05)，且四組CD3-CD56+CD16+NK細胞的純度與擴增前比較差異無顯著性(P>0.05)。在不同效靶比下(1:1，5:1，10:1)，經(jīng)培養(yǎng)擴增后NK細胞對K562細胞

5、的殺傷率(％)分別為IL-2組(23.2±2.10，40.5±3.16，72.4±1.49)，IL-2+SCF組(32.1±2.98，54.3±3.72，79.5±3.31)，IL-2+IL-15組(46.3±2.76，71.3±0.66，93.0±2.01)，IL-2+IL-15+SCF組(54.9±3.25，77.7±1.90，94.1±3.25)和空白對照組(13.6±3.06，22.9±3.35，41.5±4.00)，加入細胞因

6、子的四組殺傷率均顯著高于擴增前(13.3±1.74，19.5±2.07，40.1±3.85)(P<0.05)，空白對照組與擴增前殺傷率比較差異無顯著性(P<0.05)。加入細胞因子的四種培養(yǎng)體系中，IL-2組、IL-2+SCF組、IL-2+IL-15組和IL-2+IL-15+SCF組的殺傷活性逐漸增強，經(jīng)統(tǒng)計學分析，各組間比較差異存在顯著性(P<0.05)。
　　 3.純化的NK細胞在含10％AB血清的造血干細胞培養(yǎng)基中，加入不

7、同濃度的IL-2培養(yǎng)擴增18天，細胞存活率達93％。低濃度IL-2組，中濃度IL-2組，高濃度IL-2組的擴增倍數(shù)分別為10.48±1.20，12.86±3.78，13.42±1.92，均顯著高于空白對照組(4.815±1.39)(P<0.05)，加入IL-2的三組各組間比較差異無顯著性(P>0.05)，且三組CD3-CD56+CD16+NK細胞的純度與擴增前比較差異無顯著性(P>0.05)。在不同效靶比(1:1，5:1，10:1)下，

8、低、中、高濃度IL-2組NK細胞對K562細胞殺傷率(％)分，別為(22.2±3.24，35.2±15，68.7±2.93)，(23.6±1.65，37.1±1.95，71.6±2.15)，(32.8±3.97，46.6±3.57，80.2±3.54)，與擴增前(13.3±1.74，19.5±2.07，40.1±3.85)比較差異有顯著性(P<0.05)。高濃度IL-2組殺傷率明顯高于低、中濃度IL-2組(P<0.05)；低、中濃度IL

9、-2組殺傷率比較差異無顯著性(P>0.05)。
　　 [結論]
　　 1.應用免疫磁珠陰性分選法，可以在人外周血中分離獲得高純度且活力良好的CD3-CD56+CD16+NK細胞，并且對K562細胞有較好的殺傷活性。
　　 2.在含10％AB血清的造血干細胞培養(yǎng)基中，加入不同細胞因子組合的培養(yǎng)體系均能明顯提高經(jīng)免疫磁珠蔭性分選法純化的NK細胞體外增殖效率及殺傷活性，其中加入IL-2+IL-15+SCF組合體外擴增效