基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的肺癌類干細(xì)胞的分離和鑒定.pdf

1、目的:本研究建立細(xì)胞3D培養(yǎng)方法以分離和鑒定肺癌類干細(xì)胞，并與2D培養(yǎng)方法比較，初步探討該方法在評(píng)價(jià)肺癌體外增殖、凋亡、侵襲和藥物反應(yīng)性方面的應(yīng)用。
　　方法:
　　1.3D細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立
　　將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549以104個(gè)/孔的細(xì)胞與RPMI1640和BME為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)7天，用分散酶和回收液消化并將細(xì)胞回收傳代，進(jìn)行類干細(xì)胞篩選，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表型。收集各組培養(yǎng)3、7、1

2、1、14、20天的細(xì)胞，分別制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)細(xì)胞/100μl，分別用抗體標(biāo)記物(CD44、CD326、CD24)標(biāo)記，同時(shí)標(biāo)記FITC-IgG2b、APC-IgG1、PE-IgG1作為對(duì)照進(jìn)行流式細(xì)胞儀免疫表型檢測(cè)。
　　2.肺癌干細(xì)胞功能檢測(cè)
　　將3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞進(jìn)行體外成球、耐藥性、體內(nèi)成瘤及類干細(xì)胞鑒定，并與2D培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行比較。將各組培養(yǎng)的細(xì)胞以5000個(gè)/3ml MFM的密度接種到

3、6孔板中，7天后觀察細(xì)胞的成球率。分別接種數(shù)目為5×104個(gè)細(xì)胞/只接種到SCID裸鼠體內(nèi)，每組4只。每三天測(cè)量瘤塊大小，并繪制生長(zhǎng)曲線。并且利用Matrigel和Transwell構(gòu)建侵襲小室進(jìn)行高侵襲性和低侵襲性細(xì)胞群的分離，利用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩組肺癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。
　　3.3D細(xì)胞培養(yǎng)在抗癌藥藥效學(xué)方面的應(yīng)用
　　再將兩組培養(yǎng)的A549細(xì)胞通過(guò)MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的順

4、鉑耐藥性的變化，并通過(guò)Western blot檢測(cè)兩組肺癌類干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.3D細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立
　　經(jīng)過(guò)3D培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入2D培養(yǎng)系統(tǒng)后其增長(zhǎng)速率逐漸增快，并顯著高于2D培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞表型檢測(cè)證明3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞中CD44和CD326陽(yáng)性比例升高，CD24陽(yáng)性比例下降。
　　2.肺癌干細(xì)胞功能檢測(cè)
　　3D培養(yǎng)的細(xì)胞體外成球率顯著升高（28.50±1.17％

5、vs8.67±0.80％，P＜0.01），體內(nèi)成瘤時(shí)間顯著縮短（20.75±0.85d vs60.25±1.49d，P＜0.01）。侵襲能力和劃痕修復(fù)能力增強(qiáng)（125.67±6.028 vs64.67±11.37，83.75±5.84％ vs35.63±3.05％，P＜0.01），3D培養(yǎng)的干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)顯著高于2D。
　　3.3D細(xì)胞培養(yǎng)在抗癌藥藥效學(xué)方面的應(yīng)用
　　在兩種培養(yǎng)中分別加入不同濃度的順鉑和培美曲塞兩種腫瘤

6、藥物發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性顯著提高(58.17±2.19％ vs33.27±5.76％ in48h，P＜0.01)，（41.70±5.81％vs27.30±4.25％ in72h，P＜0.01），加藥后β-catenin蛋白的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2D培養(yǎng)的細(xì)胞加藥后的表達(dá)。結(jié)合MTT檢測(cè)得出順鉑和培美曲塞對(duì)經(jīng)過(guò)3D培養(yǎng)的A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50分別為6.58±1.25μg/ml和7.86±1.60μg/ml。
　　結(jié)論