基于2D和3D Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)研究納米氧化鋅的安全性.pdf

1、納米氧化鋅是一種應(yīng)用前景廣泛的多功能無機(jī)納米材料，其具有粒徑微小、比表面活性高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于化妝品、電子產(chǎn)品、藥物載體、醫(yī)藥和食品包裝材料。隨著人們與納米氧化鋅接觸的日益增多，其對人類健康的潛在毒性影響也引起了高度關(guān)注。研究納米材料對細(xì)胞毒性的眾多試驗(yàn)中，二維（2D）單層細(xì)胞培養(yǎng)仍然是占主導(dǎo)地位的體外模型。在傳統(tǒng)2D塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)失去其原有的組織結(jié)構(gòu)，極性以及蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用，而且相比體內(nèi)模型往往會(huì)改

2、變細(xì)胞的代謝、表型以及基因表達(dá)。當(dāng)二維細(xì)胞培養(yǎng)模型擴(kuò)展到納米毒理學(xué)研究，它的這些限制有可能導(dǎo)致獲得誤導(dǎo)性結(jié)果和結(jié)論的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)際上在體內(nèi)的所有細(xì)胞都生長在一個(gè)三維（3D）環(huán)境中，單個(gè)細(xì)胞的表型和功能是高度依賴于三維組織-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白和鄰近細(xì)胞的復(fù)雜相互作用。因此，在一個(gè)高度模擬體內(nèi)生理環(huán)境的體外3D模型中進(jìn)行納米粒子的毒性研究可以為納米材料的生物安全性評(píng)價(jià)提供更多理論基礎(chǔ)和參考價(jià)值。
　　為了評(píng)估不同粒徑的納米氧化鋅在2

3、D和3D培養(yǎng)模型中對人結(jié)腸癌上皮（Caco-2）細(xì)胞的毒性作用，首先通過透射電鏡和納米粒度儀對納米氧化鋅粒子的形狀、粒徑大小和分布進(jìn)行表征。在2D和3D培養(yǎng)條件下，利用倒置顯微鏡觀察納米氧化鋅染毒Caco-2細(xì)胞對其形態(tài)的影響，采用MTT比色法檢測細(xì)胞活性，對細(xì)胞內(nèi)ROS水平，炎癥因子白細(xì)胞介素-8（IL-8）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）進(jìn)行檢測，通過熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染后的2D細(xì)胞死亡形態(tài)，同時(shí)借助流式細(xì)胞儀檢測不同的細(xì)胞

4、死亡方式。試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　（1）三種納米氧化鋅樣品的平均粒徑為24.53±8.54nm，56.18±9.56nm，87.26±13.47nm。
　?。?）納米氧化鋅引起2D細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，而沒有引起3D細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。24nm納米氧化鋅對2D細(xì)胞的毒性最大，56nm納米氧化鋅略低，87nm納米氧化鋅則最小。三種納米氧化鋅的3D細(xì)胞活力差異沒有顯著性，表明納米氧化鋅的粒徑大小對3D細(xì)胞的毒性影響沒有明顯差異。3

5、D細(xì)胞活性明顯高于2D細(xì)胞，表明納米氧化鋅對2D細(xì)胞毒性明顯高于3D細(xì)胞。
　?。?）3D細(xì)胞相比2D細(xì)胞具有更高的基礎(chǔ)ROS水平。2D細(xì)胞的ROS水平呈依賴劑量的方式增加，而3D細(xì)胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有顯著增加。24nm納米氧化鋅誘導(dǎo)2D細(xì)胞氧化應(yīng)激程度最高，56nm納米氧化鋅略低，87nm納米氧化鋅則最低，而粒徑大小對3D細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激程度的影響沒有明顯差異。高濃度納米氧化鋅（≥75μg/mL）染毒12h后誘導(dǎo)2D細(xì)胞氧化應(yīng)激程度

6、高于3D細(xì)胞。相比2D細(xì)胞，納米氧化鋅誘導(dǎo)了3D細(xì)胞強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。3D細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)量呈劑量依賴方式增加，24nm納米氧化鋅誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)最強(qiáng)烈。24nm和56nm納米氧化鋅誘導(dǎo)2D細(xì)胞炎癥反應(yīng)的結(jié)果相似，而87nm納米氧化鋅相對較低。在3D培養(yǎng)條件下，納米氧化鋅誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與ROS水平無關(guān)。
　?。?）在2D培養(yǎng)條件下濃度為75μg/mL的24nm納米氧化鋅引起的晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞數(shù)量最多。在兩種細(xì)胞培養(yǎng)條件下24nm