端粒相關(guān)因子表達與細胞復(fù)制性衰老關(guān)系研究.pdf

1、衰老是細胞的重要生命現(xiàn)象，研究細胞衰老的發(fā)生及調(diào)節(jié)機理是人類認識生命規(guī)律的重要組成內(nèi)容，同時也為衰老相關(guān)疾病的防治提供堅實的理論基礎(chǔ)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，端粒長度的縮短是造成細胞復(fù)制性衰老的原因，而端粒的長度受端粒相關(guān)因子的調(diào)節(jié)。因此，研究端粒相關(guān)因子與細胞復(fù)制性衰老之間的關(guān)系能夠揭示細胞衰老機制。 Hayflick證實在體外培養(yǎng)的人二倍體成纖維細胞隨所傳代數(shù)的增加，細胞的增殖能力逐漸喪失，Hayflick將這種人正常體細胞在體外

2、分裂潛能受限的現(xiàn)象稱為細胞復(fù)制性衰老。人胚肺成纖維細胞(HEL)屬于二倍體成纖維細胞，具有復(fù)制性衰老的特性，因此選用HEL細胞作為研究對象，通過建立HEL細胞復(fù)制性衰老模型，來模擬正常細胞的衰老過程。 目前已發(fā)現(xiàn)與端粒相關(guān)的因子有很多，這些因子調(diào)節(jié)細胞端粒結(jié)構(gòu)和長度的變化，在細胞復(fù)制性衰老過程中發(fā)揮各自不同的重要作用。研究表明，TRF1調(diào)節(jié)POT1與端粒ssDNA的結(jié)合過程，Tankyrase1調(diào)節(jié)TRF1與dsDNA的結(jié)合程度

3、與狀態(tài)。端?？s短過程涉及Tankyrase1對TRF1的作用；而端粒3'突出端縮短的過程則涉及TRF1與POT1。它們對于細胞復(fù)制性衰老起重要作用。雖然這些端粒相關(guān)因子與細胞衰老密切相關(guān)已經(jīng)被認可，但是它們對端粒結(jié)構(gòu)及端粒長度變化的作用多是通過以腫瘤細胞為研究對象而獲得的。對于在正常細胞復(fù)制性衰老過程中它們是如何發(fā)揮作用的以及在細胞復(fù)制性衰老過程中會發(fā)生何種變化等許多問題還遠沒有得到闡明。此外，端粒酶RNA組分(hTR)是端粒酶的重要組

4、成部分，正常細胞不具有端粒酶活性，但在正常細胞卻存在hTR，它對細胞復(fù)制性衰老起作用嗎?因此我們選用Tankyrase1、TRF1、POT1、hTR作為研究對象，研究它們與細胞復(fù)制性衰老之間的關(guān)系。 本實驗首先通過分離培養(yǎng)獲得HEL細胞，按1：2分瓶傳代直至其衰老，計算每傳一代的PD值，累計算出最終PD為64。培養(yǎng)后期細胞輪廓變得不再鮮明，細胞變粗、變大、形態(tài)不規(guī)則，細胞質(zhì)內(nèi)黑色顆粒增多。細胞形態(tài)所發(fā)生的變化表明細胞衰老了。進一

5、步從分子水平上對細胞衰老加以驗證。培養(yǎng)后期細胞衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶表達量增加，端粒的長度變短。p21WAF-1隨著細胞的PD增加蛋白表達量增加，當(dāng)細胞進入衰老狀態(tài)后，p21WAF-1的蛋白表達量趨于一平臺。以上這些檢測結(jié)果進一步證實HEL細胞復(fù)制性衰老模型建立成功。 在成功建立細胞復(fù)制性衰老模型的基礎(chǔ)上，針對端粒相關(guān)因子TRF1、Tankyrase1、hTR和POT1的表達情況，以及POT1的剪接體2與剪接體5表達情況進行了

6、研究。實驗結(jié)果顯示細胞的衰老對TRF1的轉(zhuǎn)錄沒有影響，而TRF1蛋白表達水平在細胞衰老早期隨細胞衰老逐漸升高，而后快速降低，表明TRF1的表達變化可能是引發(fā)細胞衰老的重要因子之一。實驗結(jié)果顯示隨著細胞的衰老，Tankyrase1的mRNA水平及蛋白表達水平并不隨細胞的衰老而變化，Tankyrase1對其底物TRF1聚腺苷二磷酸核糖基化水平的變化可能對人胚肺細胞的衰老更具有意義。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)POT1mRNA隨著人胚肺成纖維細胞的衰老表

7、達水平逐漸降低，由于POT1表達量的降低，影響POT1與端粒突出端ssDNA的結(jié)合能力，使POT1不足以與ssDNA結(jié)合，導(dǎo)致了端粒末端結(jié)構(gòu)的破壞，加速了細胞的衰老。通過檢測人胚肺成纖維細胞衰老過程中不同PD的HEL細胞hTR的RNA表達水平，發(fā)現(xiàn)其mRNA水平隨著細胞的衰老呈遞增趨勢。表明hTR參與細胞的衰老過程，而且很有可能是通過非端粒酶途徑，與細胞內(nèi)其它蛋白相互作用而發(fā)揮作用。 在人胚肺細胞復(fù)制性衰老過程中，端粒相關(guān)因子發(fā)