轉(zhuǎn)錄因子AKNA在T-2毒素誘導(dǎo)的生長抑制毒性中的作用研究.pdf

1、T-2毒素在我國糧食作物和飼料中廣泛存在，具有毒性強(qiáng)、脫毒困難等特點(diǎn)。動(dòng)物在長期攝入低劑量T-2毒素污染的谷物或飼料后就會(huì)引起中毒，生長發(fā)育遲緩，體重明顯下降，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。炎性因子的大量表達(dá)和生長激素(Growth hormone，GH)的缺乏是導(dǎo)致生長抑制的重要原因?；蚪M學(xué)的結(jié)果表明，10、40nM的T-2毒素顯著下調(diào)GH表達(dá)的同時(shí)也顯著下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AKNA(AT-hooktranscription factor

2、)基因表達(dá)（分別下調(diào)25.85和52.15倍），且顯著上調(diào)白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-11(Interleukin-11，IL-11)和白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)基因的表達(dá)，但是目前關(guān)于T-2毒素誘導(dǎo)GH下調(diào)的分子機(jī)制尚不清楚。轉(zhuǎn)錄因子AKNA與炎性因子的表達(dá)密切相關(guān)，當(dāng)AKNA基因被敲除時(shí)，可導(dǎo)致新生小鼠的死亡和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，引起IL-1β和干擾素-γ(Inte

3、rferon-γ，IEN-γ)基因表達(dá)量增加，但是AKNA如何調(diào)控炎性細(xì)胞因子表達(dá)的目前并不清楚。因此推測，轉(zhuǎn)錄因子AKNA可能是T-2毒素誘導(dǎo)的GH下調(diào)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，T-2毒素通過抑制AKNA表達(dá)導(dǎo)致炎性反應(yīng)以及GH合成和分泌降低。我們以轉(zhuǎn)錄因子AKNA為切入點(diǎn)，深入闡釋調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AKNA表達(dá)的分子機(jī)制以及AKNA在T-2毒素介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和GH下調(diào)中的作用，確定毒素作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為保障動(dòng)物健康，開發(fā)出高效、安全的

4、新型拮抗劑提供科學(xué)依據(jù)，并為全面評(píng)價(jià)T-2毒素的風(fēng)險(xiǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　分別用濃度為10 nM和40 nM的T-2毒素處理GH3細(xì)胞0.5、1、2、4、8和12h，用濃度為5nM、10nM、20nM、40nM和80nM的T-2毒素處理GH3細(xì)胞12h，通過qRT-PCR檢測AKNA的mRNA表達(dá)水平與T-2毒素間的時(shí)效關(guān)系與量效關(guān)系，結(jié)果表明T-2毒素可呈時(shí)間依賴型和劑量依賴型的下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AKNA的表達(dá)。用不同的信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理

5、細(xì)胞后，再加入T-2毒素，以篩選T-2毒素作用下參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AKNA的信號(hào)通路，結(jié)果表明PKA/CREB、NF-κB和MAPK/p38信號(hào)通路抑制劑能顯著逆轉(zhuǎn)T-2毒素所致的AKNA表達(dá)的下調(diào)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AKNA啟動(dòng)子區(qū)含有PKA/CREB和NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白CREB和p65基因上的結(jié)合位點(diǎn)。將構(gòu)建成功的CREB和p65過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到GH3細(xì)胞，結(jié)果顯示過表達(dá)CREB和p65后轉(zhuǎn)錄因子AKNA表達(dá)水平顯著下調(diào)

6、，表明CREB和p65可負(fù)調(diào)控AKNA的表達(dá)，PKA/CREB和NF-κB信號(hào)通路可能是調(diào)控AKNA表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)通路。
　　用40nM的T-2毒素分別孵育GH3細(xì)胞0.5、1、2、4、8和12h，采用間接免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀測CREB和p65的磷酸化入核過程和AKNA在細(xì)胞中的位置。未加毒素處理時(shí)，磷酸化CREB主要位于細(xì)胞核，磷酸化p65和AKNA主要位于細(xì)胞質(zhì);T-2毒素孵育后細(xì)胞核中的磷酸化CREB和磷酸

7、化p65明顯增加，T-2毒素處理1h后細(xì)胞核中的磷酸化CREB增加最明顯，T-2毒素處理8h后細(xì)胞核中的磷酸化p65增加最明顯;轉(zhuǎn)錄因子AKNA在T-2毒素處理2h后開始進(jìn)入細(xì)胞核，8h后入核最明顯。由此可知，T-2毒素促使CREB和p65蛋白磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活PKA/CREB和NF-κB/p65信號(hào)通路，調(diào)控下游基因的表達(dá);在大鼠細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子AKNA主要位于細(xì)胞質(zhì)，T-2毒素可促使AKNA進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮毒理效應(yīng)。
　

8、　為了確定CREB和p65調(diào)控AKNA的作用方式，通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)CREB和p65可極顯著下調(diào)AKNA啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。通過染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，CREB蛋白和p65蛋白可分別與AKNA基因近端啟動(dòng)子(-1862bp和-1476bp)結(jié)合，T-2毒素可顯著增加CREB和p65與AKNA啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性。由此可知，磷酸化CREB和磷酸化p65蛋白可直接與AKNA啟動(dòng)子結(jié)合從而抑制AKNA的轉(zhuǎn)錄表

9、達(dá)，T-2毒素通過促進(jìn)磷酸化CREB和磷酸化p65蛋白與AKNA啟動(dòng)子結(jié)合從而使AKNA表達(dá)下調(diào)。
　　通過構(gòu)建pSicoR-AKNA干擾載體并轉(zhuǎn)染到GH3細(xì)胞抑制AKNA的表達(dá)，確定轉(zhuǎn)錄因子AKNA下游調(diào)控因子及其在生長抑制中的作用。抑制轉(zhuǎn)錄因子AKNA表達(dá)后加毒素處理，與僅加毒素處理組相比炎性因子IL-1β、IL-6、IL-11、TNF-α和MMP-9基因表達(dá)量降低，說明AKNA可正調(diào)控炎性細(xì)胞因子和MMP-9的表達(dá)，在T-2

10、毒素介導(dǎo)的炎性因子和MMP-9上調(diào)表達(dá)中，除了AKNA調(diào)控炎性因子表達(dá)之外，還有其他的信號(hào)通路參與T-2毒素誘導(dǎo)的炎性因子的上調(diào)表達(dá)。抑制轉(zhuǎn)錄因子AKNA表達(dá)后還發(fā)現(xiàn)GH的表達(dá)顯著下調(diào)，說明AKNA是介導(dǎo)GH下調(diào)的一個(gè)重要調(diào)控因子，在T-2毒素誘導(dǎo)GH下調(diào)的生長抑制中具有重要作用。轉(zhuǎn)錄因子AKNA很可能是T-2毒素誘導(dǎo)生長抑制的一個(gè)重要的新的靶標(biāo)。
　　綜上所述:本課題以轉(zhuǎn)錄因子AKNA為靶標(biāo)研究T-2毒素介導(dǎo)的生長抑制毒性作用機(jī)

11、理，系統(tǒng)的闡釋了調(diào)控AKNA表達(dá)的分子機(jī)制以及AKNA在T-2毒素誘導(dǎo)的GH下調(diào)和炎性細(xì)胞因子大量表達(dá)中的作用。T-2毒素可以誘導(dǎo)PKA/CREB和NF-κB/p65信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白CREB和p65表達(dá)增加，增加CREB和p65蛋白磷酸化水平，促使磷酸化p65進(jìn)入細(xì)胞核以及核內(nèi)的磷酸化CREB增加從而激活PKA/CREB和NF-κB/p65信號(hào)通路，核內(nèi)磷酸化的CREB和p65通過直接與AKNA啟動(dòng)子結(jié)合抑制AKNA的轉(zhuǎn)錄活性，從而使