T-2毒素的自然發(fā)生與降解及其在對蝦中的蓄積規(guī)律.pdf

1、產(chǎn)T-2毒素鐮孢菌廣泛存在于自然環(huán)境中，并威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康。凡納濱對蝦為我國南方沿海城市湛江的主要養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，考察T-2毒素在對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的發(fā)生情況及其在對蝦體內(nèi)的蓄積毒性不僅僅是對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求，更是保證食品安全的前提條件。本研究從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到27株鐮孢菌，選取一株鐮孢菌產(chǎn)毒培養(yǎng)后提取純化其代謝產(chǎn)物，用紅外光譜、核磁共振光譜分析，證明了其產(chǎn)物為T-2毒素，并且通過產(chǎn)毒菌株自主獲得的T-2毒素，為進(jìn)一步毒性實驗

2、提供材料支持。研究表明對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在產(chǎn)T-2毒素鐮孢菌，給凡納濱對蝦養(yǎng)殖帶來潛在危害，對T-2毒素的生物控制具有重要意義。因此，本實驗以對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的5株鐮孢菌產(chǎn)毒分離株為對象，考察其產(chǎn)毒培養(yǎng)過程中T-2毒素的變化，分離到2株T-2毒素降解菌，經(jīng)16SrRNA鑒定結(jié)果分別為彎曲假單胞菌和尼泊爾葡萄球菌，對T-2毒素的降解率分別為90.9％和85.5%，但兩者降毒能力并無顯著差異(P＞0.05)。其聯(lián)合作用也有較好降毒效果，與兩

3、菌株單獨作用無顯著差異(P＞0.05)，不同基質(zhì)對其聯(lián)合降毒作用影響不大(P＞0.05)。新的T-2毒素降解菌的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探明T-2毒素降解基因和開發(fā)T-2毒素生物降解酶提供了研究基礎(chǔ)。
　　建立高效液相色譜與多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)同步定量檢測對蝦血液、頭部、肌肉、外殼、肝胰腺和腸道中的T-2與 HT-2毒素方法。所建立方法通過選擇性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、最低檢出限和最低定量限確證，結(jié)果顯示，樣本中內(nèi)源性物質(zhì)不干

4、擾目標(biāo)物的測定，選擇性良好；不同基質(zhì)條件下線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999；T-2毒素高中低濃度在不同部位的回收率在86.38%-112.49%之間，HT-2毒素的回收率在84.29%-106.23%之間，均滿足80%-120%的范圍內(nèi)；T-2的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.95%-9.03%間，HT-2的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.21%-10.11%間，不超過15%。本實驗建立的方法靈敏度高選擇性好并且為國內(nèi)外首次建立的用LC-MS/MS檢測以對蝦不

5、同部位為基質(zhì)的T-2與HT-2毒素同步檢測方法。
　　采用探針劑量法測定、移動平均法推算凡納濱對蝦的半數(shù)致死劑量(LD50值)。得到24h內(nèi)T-2毒素在凡納濱對蝦體內(nèi)的半數(shù)致死劑量為30mg/kg BW。用灰色關(guān)聯(lián)度分析方法找出急性染毒條件下對蝦各部位毒素分布與劑量和對蝦存活時間的關(guān)聯(lián)情況。結(jié)果顯示與染毒劑量關(guān)聯(lián)度從大到小前三位依次為頭部 T-2、肝胰腺 T-2和腸道 HT-2；與染毒對蝦存活時間關(guān)聯(lián)度由大到小排前三位的依次為腸道

6、 HT-2、肝胰腺T-2和肝胰腺HT-2。所以染毒劑量與對蝦免疫器官中毒素原形含量緊密相關(guān)，存活時間與對蝦消化器官中T-2毒素的代謝產(chǎn)物含量關(guān)系密切。
　　以3mg/kg BW T-2毒素對凡納濱對蝦肌肉注射染毒，染毒后選取不同時間點取樣，用 LC-MS/MS方法定量檢測染毒蝦血液中目標(biāo)毒素濃度，用藥代動力學(xué)軟件3p97分析處理數(shù)據(jù)，得到T-2毒素血液濃度-時間數(shù)據(jù)符合權(quán)重為1/c2的三室模型，主要代謝動力學(xué)參數(shù)為k12:0.00

7、 min-1；k21:9.66×10-2 min-1；k13:5.14×10-2 min-1；k31:1.41×10-3 min-1；k10:4.54×10-2 min-1；t1/2π:7.10 min；t1/2α:7.17 min；t1/2β:1.06×103 min；AUC:6.01×104 ng·min·g-1；CL(s):5.00×10-5 mg·（kg·min-1）-1·(ng·g-1)-1；Vc:1.10×10-3(mg·k

8、g-1)(ng·g-1)-1。檢測蝦體各部位毒素分布情況，得出毒素在對蝦體內(nèi)的分布規(guī)律。
　　按定期遞增量法進(jìn)行機(jī)體耐受性和蓄積性研究，通過蓄積系數(shù)K來評價蓄積作用強(qiáng)弱，并判斷對蝦在小劑量長期染毒情況下是否出現(xiàn)對T-2毒素的耐受性。在上述研究基礎(chǔ)上設(shè)定染毒劑量組和方法，檢測目標(biāo)毒素在凡納濱對蝦血液、肌肉、肝胰腺、腸道、外殼中的蓄積量。按定期遞增劑量法染毒對蝦后分析其組織病理學(xué)變化情況。根據(jù)結(jié)果計算得到蓄積系數(shù)K=0.85＜1，表明

9、T-2毒素在凡納濱對蝦體內(nèi)高度蓄積。凡納濱對蝦對T-2毒素?zé)o明顯耐受。在口服T-2毒素劑量為0.5、1.5、4.5、13.5 mg/kg的染毒飼料20d后，用LC-MS/MS方法檢測血液、頭部、肌肉、外殼、肝胰腺和腸道中 T-2或 HT-2毒素，結(jié)果顯示均未檢出。定期遞增劑量法飼喂凡納濱對蝦后第八天腸道、肝胰腺和肌肉樣品病理切片顯示出現(xiàn)不同程度病變。表明T-2毒素在凡納濱對蝦體內(nèi)有功能蓄積，并可能以隱蔽態(tài)形式存在。本研究為T-2毒素在凡