T-2毒素及其主要代謝物HT-2毒素在BeWo細(xì)胞中的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究.pdf

1、T-2毒素是鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種A類單端孢霉烯族毒素,它是單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的一種,廣泛分布于自然界,是較常見的污染谷物與糧食的主要毒素。大量體內(nèi)研究表明,孕期經(jīng)不同給藥方式給予哺乳動(dòng)物不同劑量的T-2毒素可引發(fā)嚴(yán)重的母體毒性和胎仔毒性。對(duì)于T-2毒素的致畸毒性作用有學(xué)者認(rèn)為是其對(duì)母體的強(qiáng)烈毒性作用而間接導(dǎo)致的；但也有研究推測(cè)T-2毒素很可能通過(guò)胎盤屏障對(duì)胎鼠產(chǎn)生直接的毒性作用。胎盤屏障是母體血與胎兒血在胎盤內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)交換所通過(guò)的

2、結(jié)構(gòu),是母體供給胎兒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一通道,但也是病毒、毒素、藥物、激素等進(jìn)入胎兒的必經(jīng)之路。至今尚沒(méi)有定量的研究證實(shí)T-2毒素通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi),并且其主要主要代謝物HT-2毒素是否也能通過(guò)胎盤屏障到達(dá)胎兒體內(nèi)是未知的,而進(jìn)入胎兒的T-2毒素是否會(huì)通過(guò)胎盤發(fā)生逆向的交換也是值得關(guān)注的,因此為了揭示T-2毒素在胎兒發(fā)育毒性和致畸毒性中所起到的作用,研究其在胎盤中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是十分必要的。
　　 本課題通過(guò)建立BeWo細(xì)胞模型模擬

3、胎盤屏障,運(yùn)用轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)和攝取試驗(yàn),考察T-2毒素及HT-2毒素跨胎盤屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的特征,從而闡明T-2毒素的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,為T-2毒素的發(fā)育毒性和致畸毒性提供合理解釋。
　　 通過(guò)BeWo細(xì)胞在Transwell系統(tǒng)中的生長(zhǎng)特性考察,在本實(shí)驗(yàn)室條件下成功建立了穩(wěn)定可靠的胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞模型。通過(guò)三項(xiàng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)判斷模型的可靠性和穩(wěn)定性,在根本上保證了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。模型考察結(jié)果顯示:BeWo細(xì)胞以2.24×105 cells/mL

4、的密度接種于Transwell中,生長(zhǎng)到第七天細(xì)胞跨膜電阻符合要求,熒光黃通透率也符合模型的考察要求。
　　 通過(guò)在Transwell模型中進(jìn)行T-2毒素和HT-2毒素的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn),考察其雙向轉(zhuǎn)運(yùn)特性。結(jié)果表明T-2毒素在兩個(gè)方向上的轉(zhuǎn)運(yùn)具有顯著的方向性,即吸收方向的轉(zhuǎn)運(yùn)速率大于分泌方向；同時(shí)兩個(gè)方向的轉(zhuǎn)運(yùn)都具有一定的濃度依賴性,在高濃度也無(wú)法達(dá)到飽和。P-gp抑制劑劑維拉帕米、MRP抑制劑MK571以及BCRP抑制劑Ko

5、143對(duì)T-2毒素兩個(gè)方向上的轉(zhuǎn)運(yùn)均無(wú)顯著影響。表明T-2毒素在外排方向上的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與,推測(cè)其主要外排機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散。HT-2毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)不具有不對(duì)稱性的特點(diǎn),其在吸收方向的轉(zhuǎn)運(yùn)速率與外排方向的轉(zhuǎn)運(yùn)速率非常接近。并且也具有濃度依賴性,隨濃度的升高,兩個(gè)方向的轉(zhuǎn)運(yùn)速率都隨比例升高。P-gp、MRP、BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑均沒(méi)有對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)造成影響。表明HT-2轉(zhuǎn)運(yùn)主要是以被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)行。
　　 通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板中

6、進(jìn)行攝取試驗(yàn)考察這兩種毒素的從母體-胎兒方向的吸收特性,考察不同條件下BeWo細(xì)胞對(duì)這兩種毒素的吸收情況來(lái)探討他們的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的種類。試驗(yàn)結(jié)果表明T-2毒素在攝取方向具有飽和特性,證明載體蛋白的存在。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OAT)抑制劑DIDS、PAH和Probencid對(duì)T-2毒素的攝取都產(chǎn)生了顯著性抑制作用,表明OAT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族參與了T-2毒素在BeWo細(xì)胞中的攝??；Cimetidine和TEA是有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OCT)的抑制劑

7、,在一定程度上也抑制了T-2毒素的攝取,表明T-2毒素的攝取有一部分是由這類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。另外其Na+依賴性、質(zhì)子梯度依賴性,同時(shí)其顯著的pH依賴特性表明參與其轉(zhuǎn)運(yùn)的可能為OATP-B轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同時(shí)參與T-2毒素的攝取。而HT-2的攝取不具有飽和特性,其攝取不具有Na+依賴性、質(zhì)子梯度依賴性,OCT蛋白抑制劑對(duì)其攝取不產(chǎn)生作用,而僅OAT蛋白抑制劑對(duì)其攝取有影響,表明其主要從母體-胎兒方向的攝取方式為被動(dòng)擴(kuò)散。
　

8、　 本課題在體外系統(tǒng)中,首次定量證實(shí)了T-2毒素和HT-2毒素可以通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒,T-2毒素在母體-胎兒方向轉(zhuǎn)運(yùn)顯著高于從胎兒-母體,而HT-2毒素在兩方向上轉(zhuǎn)運(yùn)速率相當(dāng)；并且首次研究了胎盤中表達(dá)的幾種主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與這兩種毒素在胎盤中發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)ABC外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在T-2毒素和HT-2毒素從胎兒-母體外排方向上的轉(zhuǎn)運(yùn)不參與介導(dǎo)作用,并且T-2毒素在母體-胎兒方向轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)由載體介導(dǎo)的主動(dòng)過(guò)程,而HT-2毒素的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式