T-2毒素及其主要代謝物HT-2毒素在BeWo細胞中的胎盤轉運機制研究.pdf

1、T-2毒素是鐮刀菌屬產生的一種A類單端孢霉烯族毒素,它是單端孢霉烯族毒素中毒性最強的一種,廣泛分布于自然界,是較常見的污染谷物與糧食的主要毒素。大量體內研究表明,孕期經不同給藥方式給予哺乳動物不同劑量的T-2毒素可引發(fā)嚴重的母體毒性和胎仔毒性。對于T-2毒素的致畸毒性作用有學者認為是其對母體的強烈毒性作用而間接導致的；但也有研究推測T-2毒素很可能通過胎盤屏障對胎鼠產生直接的毒性作用。胎盤屏障是母體血與胎兒血在胎盤內進行物質交換所通過的

2、結構,是母體供給胎兒營養(yǎng)物質的唯一通道,但也是病毒、毒素、藥物、激素等進入胎兒的必經之路。至今尚沒有定量的研究證實T-2毒素通過胎盤屏障進入胎兒體內,并且其主要主要代謝物HT-2毒素是否也能通過胎盤屏障到達胎兒體內是未知的,而進入胎兒的T-2毒素是否會通過胎盤發(fā)生逆向的交換也是值得關注的,因此為了揭示T-2毒素在胎兒發(fā)育毒性和致畸毒性中所起到的作用,研究其在胎盤中的轉運機制是十分必要的。
　　 本課題通過建立BeWo細胞模型模擬

3、胎盤屏障,運用轉運試驗和攝取試驗,考察T-2毒素及HT-2毒素跨胎盤屏障轉運的特征,從而闡明T-2毒素的胎盤轉運機制,為T-2毒素的發(fā)育毒性和致畸毒性提供合理解釋。
　　 通過BeWo細胞在Transwell系統(tǒng)中的生長特性考察,在本實驗室條件下成功建立了穩(wěn)定可靠的胎盤轉運細胞模型。通過三項質控標準判斷模型的可靠性和穩(wěn)定性,在根本上保證了試驗結果的可靠性和真實性。模型考察結果顯示:BeWo細胞以2.24×105 cells/mL

4、的密度接種于Transwell中,生長到第七天細胞跨膜電阻符合要求,熒光黃通透率也符合模型的考察要求。
　　 通過在Transwell模型中進行T-2毒素和HT-2毒素的跨細胞膜轉運試驗,考察其雙向轉運特性。結果表明T-2毒素在兩個方向上的轉運具有顯著的方向性,即吸收方向的轉運速率大于分泌方向；同時兩個方向的轉運都具有一定的濃度依賴性,在高濃度也無法達到飽和。P-gp抑制劑劑維拉帕米、MRP抑制劑MK571以及BCRP抑制劑Ko

5、143對T-2毒素兩個方向上的轉運均無顯著影響。表明T-2毒素在外排方向上的轉運沒有主動轉運蛋白的參與,推測其主要外排機制為被動擴散。HT-2毒素的轉運不具有不對稱性的特點,其在吸收方向的轉運速率與外排方向的轉運速率非常接近。并且也具有濃度依賴性,隨濃度的升高,兩個方向的轉運速率都隨比例升高。P-gp、MRP、BCRP轉運蛋白抑制劑均沒有對其轉運造成影響。表明HT-2轉運主要是以被動擴散的方式進行。
　　 通過在標準細胞培養(yǎng)板中

6、進行攝取試驗考察這兩種毒素的從母體-胎兒方向的吸收特性,考察不同條件下BeWo細胞對這兩種毒素的吸收情況來探討他們的轉運蛋白的種類。試驗結果表明T-2毒素在攝取方向具有飽和特性,證明載體蛋白的存在。有機陰離子轉運蛋白(OAT)抑制劑DIDS、PAH和Probencid對T-2毒素的攝取都產生了顯著性抑制作用,表明OAT轉運蛋白超家族參與了T-2毒素在BeWo細胞中的攝??；Cimetidine和TEA是有機陽離子轉運蛋白(OCT)的抑制劑

7、,在一定程度上也抑制了T-2毒素的攝取,表明T-2毒素的攝取有一部分是由這類轉運蛋白介導。另外其Na+依賴性、質子梯度依賴性,同時其顯著的pH依賴特性表明參與其轉運的可能為OATP-B轉運蛋白家族。多種轉運蛋白同時參與T-2毒素的攝取。而HT-2的攝取不具有飽和特性,其攝取不具有Na+依賴性、質子梯度依賴性,OCT蛋白抑制劑對其攝取不產生作用,而僅OAT蛋白抑制劑對其攝取有影響,表明其主要從母體-胎兒方向的攝取方式為被動擴散。
　

8、　 本課題在體外系統(tǒng)中,首次定量證實了T-2毒素和HT-2毒素可以通過胎盤屏障進入胎兒,T-2毒素在母體-胎兒方向轉運顯著高于從胎兒-母體,而HT-2毒素在兩方向上轉運速率相當；并且首次研究了胎盤中表達的幾種主要轉運蛋白與這兩種毒素在胎盤中發(fā)生轉運的關系,發(fā)現(xiàn)ABC外排轉運蛋白在T-2毒素和HT-2毒素從胎兒-母體外排方向上的轉運不參與介導作用,并且T-2毒素在母體-胎兒方向轉運是一個由載體介導的主動過程,而HT-2毒素的主要轉運方式