T-2毒素對雞脛骨生長板軟骨細胞的毒害及其機理研究.pdf

1、T-2毒素是毒性最強的A型單端孢霉烯族化合物，也是一種常見的引起動物骨發(fā)育不良的真菌毒素。T-2毒素引起的肉雞骨發(fā)育異常主要表現(xiàn)為脛骨生長板軟骨發(fā)育不良。發(fā)病雞脛骨生長板軟骨細胞不能進行正常的軟骨內骨化，在骨骺端形成軟骨栓楔入骨骺甚至深入到骨髓腔，引起病雞關節(jié)畸形，脛骨干髓區(qū)脆弱，最終導致骨折發(fā)病率大大增加。研究表明，此種疾病的主要原因是骨骺生長板軟骨細胞發(fā)育停滯、凋亡或壞死進而造成正常的軟骨內骨化過程紊亂。然而，過去關于T-2毒素對骨

2、系統(tǒng)毒害作用的體內與體外研究主要集中在發(fā)病動物脛骨的病理變化和T-2毒素對關節(jié)軟骨細胞體外代謝的影響等方面的研究，對T-2毒素作用于長骨發(fā)生器官生長板軟骨細胞的毒性研究相對較少。因此，為揭開T-2毒素對生長板軟骨細胞毒害作用和為生產實踐提供科學的防治方法，同時為T-2毒素引起的人或動物疾病機理的研究提供借鑒，本試驗利用本實驗室建立的雞生長板軟骨細胞的體外培養(yǎng)體系，展開T-2毒素對生長板軟骨細胞的毒害及機制的研究。
　　 試驗I雞

3、生長板軟骨細胞的分離、培養(yǎng)與生物學特性的研究
　　 體外培養(yǎng)的原代生長板軟骨細胞是研究骨生長板發(fā)育及調節(jié)的一個重要工具，對軟骨組織工程的研究也有重要的意義。同時，各種原因導致的生長板軟骨發(fā)育不良的疾病機制的深入研究，也促使建立一種簡易、高效的生長板軟骨細胞體外的培養(yǎng)方法。本試驗收集6w齡肉雞的脛骨生長板，削成薄片后置于含有0.1％膠原酶和0.1%透明質酸酶的消化液中，37℃消化14～16 h。經梯度離心獲得的軟骨細胞懸浮于高糖D

4、MEM(含10% FBS)培養(yǎng)基，然后按105個/cm2接種于培養(yǎng)板，觀察和分析軟骨細胞的生物學特征。應用MTT法測定軟骨細胞增殖速度并繪制生長曲線，倒置顯微鏡和電鏡下觀察軟骨細胞的形態(tài)結構、甲苯胺藍染色鑒定細胞分泌的基質和用II型膠原和骨鈣素的免疫組織化學法進一步鑒定軟骨細胞分泌的特異性蛋白．同時，試驗過程中測定了軟骨細胞膠原蛋白和酸性蛋白聚糖的含量變化、堿性磷酸酶的活性和軟骨細胞肥大化時的特異性基因X型膠原mRNA的表達。最后用茜素

5、紅結合試驗測定軟骨細胞在體外的鈣化能力。結果表明，采用本試驗方法所分離的生長板軟骨細胞成活率達98%以上；原代培養(yǎng)細胞呈圓形或多角形且II型膠原陽性染色細胞比例大于98%。堿性磷酸酯酶、膠原及細胞外基質合成和X型膠原mRNA表達隨細胞培養(yǎng)時間的延長出現(xiàn)了一個周期性的變化。軟骨細胞培養(yǎng)初期添加25μg·mL-1的維生素C有助于防止軟骨細胞退化。結論：本試驗建立的生長板軟骨細胞分離、培養(yǎng)方法可獲得高純度、高活性的軟骨細胞。分離培養(yǎng)的軟骨細胞

6、可在體外培養(yǎng)過程中保持表型，逐漸成熟和最終礦化軟骨細胞外基質，為探討其生物學特性、軟骨細胞增殖分化的調控和軟骨組織工程的研究建立了基礎．
　　 試驗Ⅱ無機磷誘導的生長板軟骨細胞體外鈣化體系的建立
　　 磷是參與動物骨代謝的重要元素之一，它在生長板軟骨細胞終末分化過程中起著重要的作用。本試驗通過在體外培養(yǎng)的生長板軟骨細胞的培養(yǎng)基中添加不同濃度的無機磷(0～7 mmol·L-1)，研究磷在體外環(huán)境下對細胞終末分化及鈣化的影響

7、。試驗結果表明，(1)無機磷可降低軟骨細胞增長速度，促進軟骨細胞的分化；(2)磷對成熟型的生長板軟骨細胞的促進鈣化作用明顯，對不成熟軟骨細胞的鈣化促進作用較?。?3)磷誘導軟骨細胞鈣化的能力與軟骨細胞體外培養(yǎng)的時間和細胞的匯合程度密切相關，即培養(yǎng)時間越長，匯合程度越高，磷誘導其鈣化的速度越快，且誘導鈣化需要的磷的濃度也越低；在此過程中，細胞開始鈣化時，細胞內堿性磷酸酯酶的活性最高。(4)高濃度(7 mmol·L-1)的無機磷引起細胞的迅

8、速死亡。茜素紅染色表明，高濃度與低濃度無機磷形成的鈣化結節(jié)的機制可能不一樣，添加3 mmol·L-1的無機磷更有助于軟骨細胞的生理性鈣化作用。通過此種方法建立的生長板軟骨細胞體外鈣化體系為下一步關于軟骨細胞鈣化機制的研究奠定了基礎，同時也為研究那些影響軟骨細胞鈣化過程的因素提供一個可體外操作的研究的體系。
　　 試驗Ⅲ T-2毒素對生長板軟骨細胞增殖、分化和鈣化的影響
　　 T-2毒素是常見的影響動物骨發(fā)育的毒素之一，它

9、可引起快速生長的肉雞脛骨生長板的肥大軟骨細胞不能正常的鈣化，導致骨骺軟骨發(fā)育畸形．本試驗利用本試驗室建立的軟骨細胞體外培養(yǎng)體系研究T-2毒素對體外培養(yǎng)的軟骨細胞增殖、分化和鈣化的影響，為進一步研究T-2毒素引起動物骨發(fā)育不良的機理打下基礎。雞生長軟骨細胞分離、培養(yǎng)到匯合后培養(yǎng)在含3 mmol·L-1無機磷的礦化培養(yǎng)基中，同時細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的T-2毒素，觀察與測定與軟骨細胞增殖、分化和鈣化相應指標。結果顯示，T-2毒素能顯著降低

10、軟骨細胞的活力（P<0.05）。同時，軟骨細胞內堿性磷酸酶(ALP)活性、蛋白聚糖的合成、培養(yǎng)細胞礦化及細胞基質層鈣，磷沉積量均顯著降低（P<0.01）．實時熒光定量PCR研究表明，暴露于T-2毒素的的軟骨細胞中的X型膠原、血管內皮生長因子及轉錄相關因子RUNX2的mRNA水平也相應的降低（P<0.05）。結論：T-2毒素可通過改變細胞的代謝活性和調節(jié)軟骨細胞發(fā)育相關基因的表達來抑制軟骨細胞的增殖分化以及隨后的礦化。
　　 試驗

11、Ⅳ T-2毒素對生長板軟骨細胞凋亡及Caspase-3基因表達的影響
　　 T-2毒素可對人和動物的多種器官產生毒害作用，誘導細胞凋亡可能是T-2毒素發(fā)揮毒害作用的重要途徑之一。本試驗通過在體外分離培養(yǎng)的軟骨細胞中添加不同濃度的T-2毒素，研究T-2毒素對培養(yǎng)軟骨細胞凋亡的影響。采用流式細胞術測定T-2毒素處理的軟骨細胞凋亡、活性氧、線粒體跨膜電位和自由[Ca2+]i的變化，Hoechst33342染色后熒光顯微鏡觀察細胞核結構

12、的變化。同時應用Real-time RT PCR的方法測定細胞凋亡相關基因Caspase-3 mRNA表達量。應用生物化學測定法測定軟骨細胞內GPx活性。結果顯示，T-2毒素可引起軟骨細胞內ROS、自由[Ca2+]i升高、線粒體跨膜電位降低(P<0.05)。Hoechst33342染色后，熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)細胞核發(fā)生凝集，呈現(xiàn)凋亡時核形態(tài)變化。同時，細胞內抗氧化酶GPx有一定程度的升高。試驗結果表明，T-2毒素可通過引起軟骨細胞穩(wěn)態(tài)

13、失衡導致生長板軟骨細胞發(fā)生凋亡性死亡。
　　 試驗V T-2毒素引起的生長板軟骨細胞氧化應激及NAC的保護作用
　　 T-2毒素是一種可引起動物多種骨發(fā)育畸形的常見真菌毒素。T-2毒素引起的氧化應激是T-2毒素引起動物發(fā)病的重要病理機制之一．在本試驗中，原代培養(yǎng)的軟骨細胞給予不同濃度T-2毒素（5，50，500 nmol·L-1）處理后，通過在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑N。乙酰半胱氨酸(NAC)研究它對T-2毒素引起的氧化應激