T-2-HT-2毒素對肉雞毒性機理及其減控作用研究.pdf

1、T-2毒素(T-2)與HT-2毒素(HT-2)均屬于A類單端孢霉烯族毒素，為梨孢鐮刀菌次級代謝產(chǎn)物。T-2/HT-2在自然界中廣泛分布，攝入體內(nèi)可對人畜健康造成損傷，在各組織器官中殘留，并導致動物發(fā)生氧化應(yīng)激與細胞凋亡。肉雞對T-2較敏感，低劑量毒素便可產(chǎn)生毒性作用，引起其采食量下降、口腔損傷、消化道潰瘍及體重減輕等。在肉雞飼喂過程中向飼料中添加物理性吸附劑可有效防止毒素對肉雞的損害。T-2可導致細胞活性降低、死亡率增高，發(fā)生氧化應(yīng)激和

2、細胞凋亡。目前，研究T-2/HT-2對動物的毒性作用報道較少，而且尚無相關(guān)文獻報道兩種毒素對肉雞體內(nèi)、體外的毒性作用。因此，本文主要從體內(nèi)、體外兩方面研究T-2/HT-2對肉雞的毒性機理及減控作用。首先建立了一種可檢測肉雞體內(nèi)T-2/HT-2的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法，隨后采用梨孢鐮刀菌接種玉米獲得發(fā)霉玉米作為毒素來源，研究肉雞自由采食發(fā)霉玉米后毒性作用及在體內(nèi)的殘留情況。由于肝是T-2產(chǎn)生毒性作用的靶器官，因此，體

3、外試驗選擇肝細胞作為研究對象。通過灌流法分離獲得原代雞肝細胞，研究T-2/HT-2對肝細胞的毒性與細胞凋亡相關(guān)機理。然后，通過向細胞培養(yǎng)基中添加有機硒，研究其對細胞毒性與氧化應(yīng)激的減控作用。最后，向發(fā)霉飼料中添加蒙脫土，研究其對T-2/HT-2產(chǎn)生毒性的減控作用。
　　首先建立一種檢測肉雞體內(nèi)T-2與HT-2的方法，即利用HPLC-MS/MS檢測心、肝、脾、肺、腎、腺胃、肌胃、小腸、肌肉、骨骼及腦中T-2/HT-2的含量。該方法利

4、用乙酸乙酯萃取毒素，然后用C18反相柱（50×2.1 mm，3μm）分離毒素，最后質(zhì)譜儀在正離子模式(ESI+)下分析毒素。該方法檢測限(LOD)為0.02～0.05μg·kg-1，定量限(LOQ)為0.08～0.15μg·kg-1;樣品回收率為58.5～110.5％，相對標準偏差(RSD)小于17.0％;基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)為33.3～124.9％，RSD小于17.1％。日內(nèi)、日間精密度及樣品穩(wěn)定性RSD均低于

5、14.7％。
　　然后用梨孢鐮刀菌接種獲得發(fā)霉玉米，檢測霉玉米中相關(guān)毒素含量。根據(jù)玉米中T-2含量，將發(fā)霉玉米以不同比例與正常飼料混合，分為對照組（正常飼料）、低劑量組(1mg·kg-1 T-2)、中劑量組（2 mg·kg-1 T-2）及高劑量組(4 mg·kg-1 T-2)，1日齡肉雞自由采食42 d。檢測各組肉雞的生理指標、生化指標、病理變化、骨計量指標、毒素殘留及氧化應(yīng)激及細胞凋亡相關(guān)mRNA的表達。結(jié)果顯示:與對照組比較，

6、毒素組肉雞體重顯著下降，增重降低，料肉比(FCR)顯著升高(P＜0.05)。血清中堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)顯著升高，總蛋白(TP)顯著降低（P＜0.05）。股骨與脛骨密度、剛度、彎曲的楊氏模量及最大載荷顯著下降（P＜0.05）。T-2/HT-2在肉雞各組織器官中不同程度殘留。肝氧化應(yīng)激與細胞凋亡相關(guān)mRNA表達也顯著上調(diào)（P＜0.05）。隨后用不同劑量的T-2/HT-2處理灌流法分

7、離的原代雞肝細胞。通過測定細胞活性（MTT法）、細胞形態(tài)（蘇木素-伊紅染色）及ALT/AST活性評價毒素產(chǎn)生的細胞毒性作用。T-2/HT-2會引起細胞凋亡，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞（Hoechst33342染色及TUNEL法），并測定細胞凋亡率和凋亡時期（AnnexinⅤ-FITC與PI雙染色法）;然后用50 nM T-2/HT-2與肝細胞孵育不同時間，檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspases-3、Caspases-7、Caspases

8、-9、P53、Bcl-2、Bax)在基因水平（熒光定量PCR）與蛋白水平（蛋白質(zhì)印跡技術(shù)）的相對表達量。與對照組相比，毒素組細胞活性顯著降低(P＜0.05)，細胞體積與數(shù)量減少，死亡細胞數(shù)增加，培養(yǎng)基中ALT/AST活性顯著增強(P＜0.05);凋亡細胞顯著增加，細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，肝細胞凋亡多為早期凋亡。50 nM T-2/HT-2處理細胞后，凋亡相關(guān)基因與蛋白發(fā)揮作用的時期集中在細胞染毒后0～24 h之間。與0h細胞

9、相比，不同時間點Bax、Caspases-3、Caspases-7、Caspases-9及P53基因相對表達量均表現(xiàn)不同程度上調(diào)(P＜0.05)，而Bcl-2基因相對表達量無顯著差異(P＞0.05)。在0～24 h之間，Bax、Caspases-3、Caspases-7、Caspases-9及P53蛋白表達量均隨時間推移顯著上調(diào)(P＜0.05)，而Bcl-2表達量隨時間推移顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　不同劑量T-2/HT-2與

10、原代肝細胞共孵育24 h，并向肝細胞培養(yǎng)液中添加DL-硒代蛋氨酸，通過測定細胞活性（MTT法）、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率評價DL-硒代蛋氨酸對肝細胞損傷的減控作用。隨后測定細胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)水平，檢測谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、GSH-PX、SOD及CAT mRNA相對表達量，評估DL-硒代蛋氨酸對氧化應(yīng)激減

11、控作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，毒素組細胞活性顯著下降，LDH漏出率顯著升高， ROS及MDA水平顯著上升，細胞內(nèi)GSH含量顯著下降，而胞內(nèi)抗氧化酶（GSH-PX、SOD及CAT）活性顯著升高，氧化應(yīng)激相關(guān)mRNA（GST、GSH-PX、SOD及CAT）表達量顯著提高（P＜0.05）。與相應(yīng)劑量的毒素組比較，試驗組細胞培養(yǎng)基添加DL-硒代蛋氨酸，可顯著增加肝細胞活性，降低LDH漏出率，減少胞內(nèi)ROS和MDA水平，提高GSH、GSH-PX

12、、SOD及CAT水平，且氧化應(yīng)激相關(guān)mRNA表達量顯著上調(diào)(P＜0.05)。通過T-2體外吸附試驗，確定蒙脫土是對T-2吸附率最高的吸附劑，以5g·kg-1的比例添加入霉飼料中，評價蒙脫土對T-2/HT-2毒性的減控作用。將肉雞分為對照組、脫毒對照組(5g·kg-1蒙脫土)、毒素組(4mg·kg-1 T-2)與脫毒組（4 mg·kg-1 T-2+5g·kg-1蒙脫土）。1日齡肉雞自由采食42 d，檢測肉雞的生理及生化指標、病理變化、骨計

13、量指標、毒素殘留及氧化應(yīng)激及細胞凋亡相關(guān)mRNA的表達。結(jié)果顯示:與毒素組比較，飼料中添加蒙脫土脫毒組肉雞體重、增重、采食量、骨密度、骨剛度、彎曲的楊氏模量及最大載荷均顯著升高(P＜0.05)，F(xiàn)CR、ALP、AST、ALT以及氧化應(yīng)激與細胞凋亡相關(guān)mRNA均顯著降低(P＜0.05）。而且脫毒組肉雞體內(nèi)各器官中T-2/HT-2含量明顯低于毒素組相應(yīng)器官中的毒素含量(P＜0.05)。
　　結(jié)論:本文建立的HPLC-MSMS檢測方法，

14、可快速、有效檢測組織器官中T-2/HT-2殘留;同時可將該方法進行推廣，作為檢測肉雞畜產(chǎn)品中毒素檢測的標準方法。肉雞采食梨孢鐮刀菌污染的玉米后，霉玉米中的T-2/HT-2可導致肉雞產(chǎn)生各方面的毒性作用，并在肉雞體內(nèi)殘留，還可誘導肉雞肝臟氧化應(yīng)激與細胞凋亡。隨后，選擇肝作為體外研究對象，發(fā)現(xiàn)T-2/HT-2可造成肉雞肝細胞產(chǎn)生毒性作用，并誘導細胞凋亡，且凋亡相關(guān)基因與蛋白在細胞凋亡機制中發(fā)揮重要作用。T-2/HT-2還可誘導肝細胞出現(xiàn)氧化