HT--2毒素與玉米赤霉烯酮對小鼠卵母細(xì)胞的毒性影響及機制.pdf

1、霉菌毒素是真菌或霉菌代謝產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在植物，糧食和土壤中均可檢測到霉菌毒素的存在。霉菌毒素分布廣泛，在全世界各大洲均有霉菌毒素的發(fā)生和存在。隨著全球貿(mào)易活動頻繁，在糧食運輸和貯藏過程中被霉菌毒素污染的可能性增加，從而造成飼料行業(yè)被霉菌毒素污染的情況更加嚴(yán)重。霉菌毒素已經(jīng)被證實不僅會對實驗動物和家畜產(chǎn)生各種毒性，同時也會影響人類健康。霉菌毒素對家畜和人類產(chǎn)生的毒性主要表現(xiàn)在影響免疫系統(tǒng)，消化系統(tǒng)，具有肝腎毒性，遺傳毒性等。其中嚴(yán)重

2、威脅家畜和人類健康的霉菌毒素主要包括玉米赤霉烯酮(ZEA)，T-2毒素和HT-2毒素，嘔吐毒素，伏馬毒素和黃曲霉毒素B1等。目前關(guān)于霉菌毒素毒性的研究很多，但是關(guān)于霉菌毒素對生殖方面的影響，尤其是對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育能力的影響以及相關(guān)毒性機制方面的研究較少。因此，本研究從體外和體內(nèi)兩個方面來探索霉菌毒素對小鼠卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育能力的影響以及生物學(xué)機制。在體外，我們選取了HT-2毒素和玉米赤霉烯酮，利用免疫熒光染色，免疫蛋白印記(west

3、ern blot)和RT-PCR等方法來探索霉菌毒素對小鼠卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育能力的影響，并且從細(xì)胞骨架，氧化應(yīng)激，凋亡自噬和表觀修飾四個方面來探索霉菌毒素的毒性機制。另外，我們又利用自然霉變的玉米配制飼料飼喂小鼠，進行體肉試驗，綜合評價了霉菌毒素對小鼠卵母細(xì)胞的毒性及其機制。本研究共分為三個部分，主要的研究結(jié)果如下:
　　一 HT-2毒素影響小鼠卵母細(xì)胞成熟
　　T-2毒素是A類單端孢霉菌毒素中毒性最強的一種毒素。目前已被證

4、實會對家畜和人類產(chǎn)生各種毒性作用，它會誘導(dǎo)大腦，淋巴，造血和腸胃組織損傷等。HT-2毒素是T-2毒素的主要代謝產(chǎn)物。關(guān)于HT-2毒素對繁殖系統(tǒng)，尤其是卵母細(xì)胞成熟方面的研究還很少，因此在本試驗中，我們主要探索了HT-2毒素對卵母細(xì)胞成熟的影響及其相關(guān)機制。HT-2毒素會影響小鼠卵母細(xì)胞成熟，降低細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中微絲的表達，并且通過降低p-MAPK的蛋白水平從而破壞紡錘體構(gòu)型。HT-2毒素也會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和凋亡，具體表現(xiàn)在會導(dǎo)致ROS積聚

5、，增加氧化應(yīng)激相關(guān)基因Sod的mRNA水平，誘導(dǎo)早期凋亡，并且提高凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Bax的mRNA水平。同時，HT-2毒素會提高自噬相關(guān)蛋白LC3和ATG12的表達水平和自噬相關(guān)基因Lc3和Atg14的表達，這意味著HT-2毒素會誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞自噬。除此之外，我們還檢測了表觀修飾方面。免疫熒光染色結(jié)果說明HT-2毒素會提高5mC的水平，而H3K9me2和H3K27me3的表達水平會下降，這些結(jié)果說明HT-2毒素會改變D

6、NA甲基化和組蛋白甲基化水平。因此，我們的結(jié)果證明，HT-2毒素會通過影響細(xì)胞骨架，凋亡自噬，氧化應(yīng)激和表觀修飾等方面進而影響小鼠卵母細(xì)胞成熟。
　　二玉米赤霉烯酮通過影響小鼠成熟卵子的表觀修飾水平進而影響成熟卵子的發(fā)育能力
　　ZEA是鐮孢霉菌產(chǎn)生的霉菌毒素，已被證實會對家畜和人產(chǎn)生毒性。但是迄今為止關(guān)于ZEA影響小鼠卵子發(fā)育到胚胎的能力方面的研究較少。在本試驗中我們發(fā)現(xiàn)，ZEA會影響小鼠卵子孤雌激活率，這說明ZEA會影響

7、小鼠卵子發(fā)育到胚胎的能力。為了深入研究，我們從表觀修飾方面探索ZEA影響小鼠卵子胚胎發(fā)育能力的可能機制。免疫熒光染色的結(jié)果分析說明ZEA會提高5mC水平，這意味著ZEA會提高小鼠卵子DNA甲基化水平。除此之外，組蛋白甲基化水平也發(fā)生了改變。高濃度ZEA處理組中卵子的H3K4me2，H3K9me3和H4K20me1，me2，me3水平顯著下降。因此，我們的結(jié)果說明ZEA會通過影響表觀修飾水平進而影響小鼠卵子胚胎發(fā)育能力。
　　三霉菌

8、毒素在體內(nèi)環(huán)境中影響小鼠GV期卵母細(xì)胞表觀修飾水平
　　霉菌毒素普遍存在于谷物和飼料中。有研究報道，霉菌毒素會提高人腸細(xì)胞系的DNA甲基化水平。我們課題組先前的研究已經(jīng)證明，霉菌毒素會影響小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，在本實驗中，我們從表觀修飾方面來探索霉菌毒素體內(nèi)降低小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的可能機制。試驗選用自然霉變的玉米配制小鼠飼料，霉變玉米添加比例依次為0％，15％和30％，用該飼料飼喂小鼠四周。免疫熒光染色結(jié)果分析說明，高濃度的霉