褪黑素對(duì)大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞影響的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景:
　　 青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)是一種伴有側(cè)方彎曲和椎體旋轉(zhuǎn)的三維脊柱畸形。約有(1-3)％10-16歲的孩子受AIS的影響,但其真正病因尚未可知。
　　 最近,針對(duì)AIS病因的研究集中在基因、脊柱生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)、褪黑素、椎旁肌、結(jié)締組織、骨質(zhì)疏松、血小板等方面。但是AIS特定的發(fā)病年齡和特殊的生長(zhǎng)發(fā)育特征表明其產(chǎn)生和發(fā)展與生長(zhǎng)發(fā)育有著肯定的聯(lián)系。在幾種生長(zhǎng)發(fā)育異常理論中,脊柱相對(duì)過(guò)快生長(zhǎng)看起來(lái)更容易

2、被接受。Murray等認(rèn)為前柱相對(duì)于后柱的過(guò)快生長(zhǎng)可以解釋脊柱側(cè)凸復(fù)雜的生物力學(xué)機(jī)制,并可以為多種病因誘導(dǎo)AIS產(chǎn)生提供最后共同通路。Guo等發(fā)現(xiàn)AIS患者有更高的T1-T12椎體并把椎體的過(guò)度縱向生長(zhǎng)歸因于過(guò)快的軟骨內(nèi)成骨,Zhu等將AIS患者頂椎區(qū)的椎體生長(zhǎng)板與先天性脊柱側(cè)凸患者正常的生長(zhǎng)板進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)AIS患者的椎體生長(zhǎng)板高度和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)指標(biāo)要高。但是針對(duì)AIS患者椎體生長(zhǎng)板的異常生長(zhǎng)機(jī)制還沒(méi)有相關(guān)研究。
　　 椎體生長(zhǎng)板

3、介于椎體骨性結(jié)構(gòu)和椎間盤組織之間。像長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板一樣,椎體生長(zhǎng)板由肥大層、增殖層、靜止層這三層構(gòu)成,椎體生長(zhǎng)板在脊柱的縱向生長(zhǎng)中起到重要作用。文獻(xiàn)表明,縱向骨生長(zhǎng)是軟骨內(nèi)骨化的結(jié)果,而軟骨內(nèi)骨化實(shí)質(zhì)上就是由軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑囊环N過(guò)程。因此研究AIS椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的異常增殖、分化可能是揭示AIS病因的有效途徑。
　　 AIS發(fā)生在生長(zhǎng)發(fā)育高峰期,而此期間正是激素變化很快的時(shí)期,考慮到AIS的高發(fā)病率(1％-3％),我們認(rèn)為激素失

4、衡可能是AIS的根本發(fā)病機(jī)制。眾所周知下丘腦-垂體-激素軸的激活是青春期內(nèi)分泌變化的核心,作為生長(zhǎng)發(fā)育的一部分,椎體生長(zhǎng)板的軟骨內(nèi)骨化肯定也受到下丘腦-垂體-激素軸的調(diào)節(jié)。很明顯,闡明下丘腦-垂體-激素軸對(duì)椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞異常增殖、分化的影響可能是發(fā)現(xiàn)AIS病因的關(guān)鍵途徑。
　　 褪黑素是一種由松果體分泌作用廣泛的激素。許多研究者發(fā)現(xiàn)褪黑素與哺乳動(dòng)物和人脊柱側(cè)凸的產(chǎn)生有著密切的關(guān)系。Machida和其他研究者發(fā)現(xiàn)松果體切除的雞

5、、雙足鼠、倉(cāng)鼠可出現(xiàn)脊柱側(cè)凸,并且Machida還發(fā)現(xiàn)中度側(cè)凸AIS患者給予褪黑素可以阻止側(cè)凸進(jìn)展。所以,有些研究者認(rèn)為動(dòng)物或人脊柱側(cè)凸的產(chǎn)生與褪黑素的減少有關(guān)。但不是所有松果體切除的動(dòng)物均產(chǎn)生脊柱側(cè)凸,AIS患者亦沒(méi)有褪黑素產(chǎn)生等方面的障礙,患有與褪黑素異常相關(guān)疾病的患者也沒(méi)有明顯的脊柱側(cè)凸出現(xiàn),所以Weinstein等推測(cè)脊柱側(cè)凸不像是單純褪黑素缺乏所致,可能是褪黑素對(duì)其他未知生長(zhǎng)機(jī)制影響的結(jié)果。
　　 已知雌激素和生長(zhǎng)激素

6、可以影響縱向骨生長(zhǎng)并且這兩種激素是下丘腦-垂體-激素軸的重要組成部分,并且雌激素與AIS的產(chǎn)生有著緊密聯(lián)系。作為一種作用廣泛的激素,褪黑素與下丘腦-垂體-激素軸密切相關(guān),并且褪黑素可以阻斷雌激素受體并且可以刺激生長(zhǎng)激素的釋放。基于以上事實(shí),我們推測(cè)褪黑素可能通過(guò)影響下丘腦-垂體-激素軸和椎體生長(zhǎng)板內(nèi)軟骨細(xì)胞的增殖、分化而在AIS的發(fā)病中產(chǎn)生重要作用。
　　 2009年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)褪黑素可以促進(jìn)豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)增加,表明褪黑素

7、可以影響軟骨細(xì)胞,但其與椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的關(guān)系還未見報(bào)道。
　　 由于受到椎體生長(zhǎng)板取材及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的限制,對(duì)AIS患者及正常人椎體整個(gè)生長(zhǎng)板的研究很難實(shí)現(xiàn),所以我們從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手,首先探討褪黑素對(duì)大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的影響及機(jī)制。
　　 研究目的:
　　 1.建立體外培養(yǎng)及鑒定大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的方法,觀察軟骨細(xì)胞的傳代特征。
　　 2.比較不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板的組織學(xué)差異并對(duì)不同年齡大鼠

8、椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行測(cè)定。
　　 3.探討大鼠脊柱椎體生長(zhǎng)板中是否有褪黑素受體的表達(dá)。
　　 4.初步探討褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的影響及機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　 (1)、大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng):
　　 采用改良胰酶和Ⅱ型膠原酶序貫消化法分離、培養(yǎng)大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞。椎體生長(zhǎng)板從4只1周齡

9、的SD大鼠獲得。將椎體生長(zhǎng)板用無(wú)菌PBS沖洗3次,0.25％胰酶消化30min,接著用0.2％Ⅱ型膠原酶消化1h,去除組織殘?jiān)髮⒆刁w生長(zhǎng)板剪成1 mm3大小,再用0.2％Ⅱ型膠原酶消化5h。收集細(xì)胞,用含10％胎牛血清和雙抗(100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基在含有5％CO2濕潤(rùn)的37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)基隔日換液,細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)采用0.25％胰酶進(jìn)行消化傳代。隨后的實(shí)驗(yàn)中采用傳1-3代的細(xì)胞。
　

10、　 (2)、大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的鑒定:
　　 原代細(xì)胞傳代后采用倒置相差顯微鏡下觀察、細(xì)胞HE染色和甲苯胺藍(lán)染色對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定,采用MTT比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 (3)、軟骨細(xì)胞傳代特征的觀察:
　　 將細(xì)胞傳代至第6代,采用倒置相差顯微鏡觀察各代軟骨細(xì)胞的形態(tài),采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定各代軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　 2.不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板的組織學(xué)觀察及增殖能力測(cè)定。

11、　　 (1)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板的組織學(xué)觀察。
　　 采用番紅O-固綠染色法對(duì)1天、1周、4周、8周、16周、28周齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板進(jìn)行染色鑒定,測(cè)定生長(zhǎng)板軟骨肥大區(qū)、增殖區(qū)、靜止區(qū)的高度。
　　 (2)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板的增殖能力測(cè)定。
　　 采用改良的胰酶和Ⅱ型膠原酶序貫消化法對(duì)以上年齡階段大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板體外培養(yǎng)

12、軟骨細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的基因表達(dá)水平,采用Westernblot法測(cè)定不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)。
　　 3.大鼠椎體生長(zhǎng)板褪黑素受體的測(cè)定
　　 (1)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞褪黑素受體。
　　 取1周大鼠椎體生長(zhǎng)板進(jìn)行軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng),傳代后通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中褪黑素受體(MT1,MT2)的表達(dá)。
　　 (2)、免疫組織

13、化學(xué)染色測(cè)定大鼠椎體生長(zhǎng)板褪黑素受體。
　　 取1天SD大鼠的椎體生長(zhǎng)板組織進(jìn)行褪黑素受體免疫組化染色,檢測(cè)椎體生長(zhǎng)板組織中褪黑素受體(MT1,MT2)的表達(dá)。
　　 (3)、褪黑素受體基因的測(cè)定。
　　 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)褪黑素兩種受體(MT1,MT2)基因的表達(dá)。
　　 (4)、褪黑素受體蛋白的測(cè)定。
　　 采用Western blot法測(cè)定褪黑素受體(MT1,MT2)蛋白的表達(dá)。
　

14、　 4.褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖、分化影響的檢測(cè)
　　 (1)、褪黑素對(duì)椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)。
　　 將不同濃度(0,0.1,1,10和100μg/ml)的褪黑素加到培養(yǎng)基里對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行刺激。褪黑素對(duì)細(xì)胞增殖的影響采用阿爾瑪藍(lán)測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè),簡(jiǎn)言之,將軟骨細(xì)胞接種至96孔板并培養(yǎng)48h,將阿爾瑪藍(lán)以10％的體積百分比加至培養(yǎng)基中并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h,采用分光光度計(jì)測(cè)量590nm時(shí)的吸光度。

15、>　　 (2)、與軟骨細(xì)胞增殖、分化相關(guān)因子的檢測(cè)。
　　 將不同濃度(0,0.1,1,10和100μg/ml)的褪黑素加到培養(yǎng)基里對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行刺激。采用Western blot法檢測(cè)PCNA(反映細(xì)胞的增殖潛能)、Sox9(控制細(xì)胞分化的核心轉(zhuǎn)錄因子)、Smad4(調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、分化的共同調(diào)節(jié)子)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　 (1)、大鼠

16、椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng):
　　 1周齡SD大鼠的椎體生長(zhǎng)板約2mm×1mm×0.5mm大小。軟骨細(xì)胞接種6h后開始貼壁,接種24h后所有細(xì)胞貼壁完成,細(xì)胞長(zhǎng)滿后呈“鋪路石”狀外觀。MTT比色法顯示,傳3代以前的軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線近似“S”形,從第4天開始細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng),第9天達(dá)平臺(tái)期,至第11天開始出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。
　　 (2)、大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的鑒定:
　　 倒置相差顯微鏡下觀察和HE染色顯示細(xì)胞基

17、本形態(tài)為多邊形,胞漿豐富,胞核較圓；甲苯胺藍(lán)染色見胞核藍(lán)染；以上的描述均符合軟骨細(xì)胞的形態(tài)特征。
　　 (3)、軟骨細(xì)胞傳代特征的觀察:
　　 體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞形態(tài)由原代的多角形逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,傳4代后細(xì)胞有成纖維化的趨勢(shì)。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色示傳3代以前的軟骨細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性,隨著傳代次數(shù)的增加軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)逐漸降低。
　　 2.不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板的組織學(xué)觀察及增殖能力

18、測(cè)定
　　 (1)、番紅O-固綠染色。
　　 1天、1周、4周、8周、16周、28周齡大鼠椎體生長(zhǎng)板番紅O-固綠染色可見生長(zhǎng)板軟骨組織被染成紅色。16周大鼠椎體生長(zhǎng)板靜止區(qū)內(nèi)開始有骨長(zhǎng)入,28周齡大鼠椎體生長(zhǎng)板仍然存在但靜止區(qū)大部分出現(xiàn)骨化現(xiàn)象。
　　 (2)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板各區(qū)高度的測(cè)量。
　　 1天及1周大鼠肥大區(qū)明顯高于其他年齡組(P<0.01)；1天及1周大鼠增殖區(qū)高于其他年齡組(P<

19、0.05),4周大鼠增殖區(qū)高于28周大鼠(P<0.05)；1天及1周大鼠靜止區(qū)高于其他年齡組(P<0.05),4周大鼠靜止區(qū)高于16周、28周大鼠(P<0.05)。
　　 (3)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長(zhǎng)板的增殖能力測(cè)定。
　　 PCNA基因的相對(duì)表達(dá)量隨年齡增加而降低；與1天大鼠相比,剩余各組PCNA基因的表達(dá)與之的差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PCNA蛋白的相對(duì)表達(dá)量隨年齡增加而減少；與1天大鼠相比,剩余各

20、組PCNA蛋白的表達(dá)與之的差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.大鼠椎體生長(zhǎng)板褪黑素受體的測(cè)定
　　 (1)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞褪黑素受體。
　　 大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞褪黑素受體免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示軟骨細(xì)胞被染成棕黃色。
　　 (2)、免疫組織化學(xué)染色測(cè)定大鼠椎體生長(zhǎng)板褪黑素受體。
　　 1天大鼠椎體生長(zhǎng)板褪黑素受體免疫組化染色示生長(zhǎng)板各層內(nèi)軟骨細(xì)胞均被染成棕黃色。

21、
　　 (3)、褪黑素受體基因的測(cè)定。
　　 與內(nèi)參基因GAPDH相比,褪黑素受體(MT1,MT2)在椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中的基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.11±0.02、0.05±0.01。
　　 (4)、褪黑素受體蛋白的測(cè)定。
　　 與內(nèi)參β-actin相比,褪黑素受體(MT1,MT2)的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.28±0.11、0.22±0.09。
　　 4.褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖、分化影

22、響的檢測(cè)
　　 (1)、褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)。
　　 10和100μg/ml的褪黑素顯著抑制傳代椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖；褪黑素的溶劑(乙醇)對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響；褪黑素的增殖抑制效應(yīng)可被褪黑素受體拮抗劑luzindole拮抗。
　　 (2)、與軟骨細(xì)胞增殖、分化相關(guān)因子的檢測(cè)。
　　 隨著褪黑素濃度增高,PCNA、Sox9和Smad4的表達(dá)水平降低。
　　 結(jié)論:

23、>　　 1.改良序貫酶消化法能成功分離和培養(yǎng)大鼠椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞,能在短時(shí)間內(nèi)獲得高純度的軟骨細(xì)胞,傳3代及3代以內(nèi)的細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的特征性表型,增殖較快。
　　 2.1天及1周大鼠椎體生長(zhǎng)板各區(qū)的高度明顯高于年齡較大的大鼠。16周大鼠椎體生長(zhǎng)板靜止區(qū)內(nèi)開始有骨長(zhǎng)入,28周齡大鼠椎體生長(zhǎng)板仍然存在但靜止區(qū)大部分出現(xiàn)骨化現(xiàn)象。隨年齡增加椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖能力逐漸下降。
　　 3.大鼠椎體生長(zhǎng)板存在褪黑素受體(M