褪黑素對大鼠椎體生長板軟骨細胞影響的相關研究.pdf

1、研究背景:
　　 青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(AIS)是一種伴有側(cè)方彎曲和椎體旋轉(zhuǎn)的三維脊柱畸形。約有(1-3)％10-16歲的孩子受AIS的影響,但其真正病因尚未可知。
　　 最近,針對AIS病因的研究集中在基因、脊柱生長發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)、褪黑素、椎旁肌、結(jié)締組織、骨質(zhì)疏松、血小板等方面。但是AIS特定的發(fā)病年齡和特殊的生長發(fā)育特征表明其產(chǎn)生和發(fā)展與生長發(fā)育有著肯定的聯(lián)系。在幾種生長發(fā)育異常理論中,脊柱相對過快生長看起來更容易

2、被接受。Murray等認為前柱相對于后柱的過快生長可以解釋脊柱側(cè)凸復雜的生物力學機制,并可以為多種病因誘導AIS產(chǎn)生提供最后共同通路。Guo等發(fā)現(xiàn)AIS患者有更高的T1-T12椎體并把椎體的過度縱向生長歸因于過快的軟骨內(nèi)成骨,Zhu等將AIS患者頂椎區(qū)的椎體生長板與先天性脊柱側(cè)凸患者正常的生長板進行對比發(fā)現(xiàn)AIS患者的椎體生長板高度和生長動力學指標要高。但是針對AIS患者椎體生長板的異常生長機制還沒有相關研究。
　　 椎體生長板

3、介于椎體骨性結(jié)構和椎間盤組織之間。像長骨生長板一樣,椎體生長板由肥大層、增殖層、靜止層這三層構成,椎體生長板在脊柱的縱向生長中起到重要作用。文獻表明,縱向骨生長是軟骨內(nèi)骨化的結(jié)果,而軟骨內(nèi)骨化實質(zhì)上就是由軟骨細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑囊环N過程。因此研究AIS椎體生長板軟骨細胞的異常增殖、分化可能是揭示AIS病因的有效途徑。
　　 AIS發(fā)生在生長發(fā)育高峰期,而此期間正是激素變化很快的時期,考慮到AIS的高發(fā)病率(1％-3％),我們認為激素失

4、衡可能是AIS的根本發(fā)病機制。眾所周知下丘腦-垂體-激素軸的激活是青春期內(nèi)分泌變化的核心,作為生長發(fā)育的一部分,椎體生長板的軟骨內(nèi)骨化肯定也受到下丘腦-垂體-激素軸的調(diào)節(jié)。很明顯,闡明下丘腦-垂體-激素軸對椎體生長板軟骨細胞異常增殖、分化的影響可能是發(fā)現(xiàn)AIS病因的關鍵途徑。
　　 褪黑素是一種由松果體分泌作用廣泛的激素。許多研究者發(fā)現(xiàn)褪黑素與哺乳動物和人脊柱側(cè)凸的產(chǎn)生有著密切的關系。Machida和其他研究者發(fā)現(xiàn)松果體切除的雞

5、、雙足鼠、倉鼠可出現(xiàn)脊柱側(cè)凸,并且Machida還發(fā)現(xiàn)中度側(cè)凸AIS患者給予褪黑素可以阻止側(cè)凸進展。所以,有些研究者認為動物或人脊柱側(cè)凸的產(chǎn)生與褪黑素的減少有關。但不是所有松果體切除的動物均產(chǎn)生脊柱側(cè)凸,AIS患者亦沒有褪黑素產(chǎn)生等方面的障礙,患有與褪黑素異常相關疾病的患者也沒有明顯的脊柱側(cè)凸出現(xiàn),所以Weinstein等推測脊柱側(cè)凸不像是單純褪黑素缺乏所致,可能是褪黑素對其他未知生長機制影響的結(jié)果。
　　 已知雌激素和生長激素

6、可以影響縱向骨生長并且這兩種激素是下丘腦-垂體-激素軸的重要組成部分,并且雌激素與AIS的產(chǎn)生有著緊密聯(lián)系。作為一種作用廣泛的激素,褪黑素與下丘腦-垂體-激素軸密切相關,并且褪黑素可以阻斷雌激素受體并且可以刺激生長激素的釋放?；谝陨鲜聦?我們推測褪黑素可能通過影響下丘腦-垂體-激素軸和椎體生長板內(nèi)軟骨細胞的增殖、分化而在AIS的發(fā)病中產(chǎn)生重要作用。
　　 2009年有學者發(fā)現(xiàn)褪黑素可以促進豬關節(jié)軟骨細胞合成基質(zhì)增加,表明褪黑素

7、可以影響軟骨細胞,但其與椎體生長板軟骨細胞的關系還未見報道。
　　 由于受到椎體生長板取材及醫(yī)學倫理學的限制,對AIS患者及正常人椎體整個生長板的研究很難實現(xiàn),所以我們從動物實驗入手,首先探討褪黑素對大鼠椎體生長板軟骨細胞的影響及機制。
　　 研究目的:
　　 1.建立體外培養(yǎng)及鑒定大鼠椎體生長板軟骨細胞的方法,觀察軟骨細胞的傳代特征。
　　 2.比較不同年齡大鼠胸椎椎體生長板的組織學差異并對不同年齡大鼠

8、椎體生長板軟骨細胞的增殖能力進行測定。
　　 3.探討大鼠脊柱椎體生長板中是否有褪黑素受體的表達。
　　 4.初步探討褪黑素對體外培養(yǎng)大鼠椎體生長板軟骨細胞的影響及機制。
　　 研究方法:
　　 1.大鼠椎體生長板軟骨細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　 (1)、大鼠椎體生長板軟骨細胞的分離與培養(yǎng):
　　 采用改良胰酶和Ⅱ型膠原酶序貫消化法分離、培養(yǎng)大鼠椎體生長板軟骨細胞。椎體生長板從4只1周齡

9、的SD大鼠獲得。將椎體生長板用無菌PBS沖洗3次,0.25％胰酶消化30min,接著用0.2％Ⅱ型膠原酶消化1h,去除組織殘渣后將椎體生長板剪成1 mm3大小,再用0.2％Ⅱ型膠原酶消化5h。收集細胞,用含10％胎牛血清和雙抗(100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基在含有5％CO2濕潤的37℃培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)基隔日換液,細胞長滿時采用0.25％胰酶進行消化傳代。隨后的實驗中采用傳1-3代的細胞。
　

10、　 (2)、大鼠椎體生長板軟骨細胞的鑒定:
　　 原代細胞傳代后采用倒置相差顯微鏡下觀察、細胞HE染色和甲苯胺藍染色對軟骨細胞進行鑒定,采用MTT比色法繪制細胞生長曲線。
　　 (3)、軟骨細胞傳代特征的觀察:
　　 將細胞傳代至第6代,采用倒置相差顯微鏡觀察各代軟骨細胞的形態(tài),采用免疫細胞化學染色鑒定各代軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達。
　　 2.不同年齡大鼠胸椎椎體生長板的組織學觀察及增殖能力測定。

11、　　 (1)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長板的組織學觀察。
　　 采用番紅O-固綠染色法對1天、1周、4周、8周、16周、28周齡大鼠胸椎椎體生長板進行染色鑒定,測定生長板軟骨肥大區(qū)、增殖區(qū)、靜止區(qū)的高度。
　　 (2)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長板的增殖能力測定。
　　 采用改良的胰酶和Ⅱ型膠原酶序貫消化法對以上年齡階段大鼠胸椎椎體生長板軟骨細胞進行原代培養(yǎng)。采用實時定量PCR檢測不同年齡大鼠胸椎椎體生長板體外培養(yǎng)

12、軟骨細胞增殖細胞核抗原(PCNA)的基因表達水平,采用Westernblot法測定不同年齡大鼠胸椎椎體生長板體外培養(yǎng)軟骨細胞PCNA蛋白的表達。
　　 3.大鼠椎體生長板褪黑素受體的測定
　　 (1)、免疫細胞化學染色測定生長板軟骨細胞褪黑素受體。
　　 取1周大鼠椎體生長板進行軟骨細胞原代培養(yǎng),傳代后通過免疫細胞化學染色測定椎體生長板軟骨細胞中褪黑素受體(MT1,MT2)的表達。
　　 (2)、免疫組織

13、化學染色測定大鼠椎體生長板褪黑素受體。
　　 取1天SD大鼠的椎體生長板組織進行褪黑素受體免疫組化染色,檢測椎體生長板組織中褪黑素受體(MT1,MT2)的表達。
　　 (3)、褪黑素受體基因的測定。
　　 通過RT-PCR檢測褪黑素兩種受體(MT1,MT2)基因的表達。
　　 (4)、褪黑素受體蛋白的測定。
　　 采用Western blot法測定褪黑素受體(MT1,MT2)蛋白的表達。
　

14、　 4.褪黑素對體外培養(yǎng)生長板軟骨細胞增殖、分化影響的檢測
　　 (1)、褪黑素對椎體生長板軟骨細胞增殖影響的檢測。
　　 將不同濃度(0,0.1,1,10和100μg/ml)的褪黑素加到培養(yǎng)基里對軟骨細胞進行刺激。褪黑素對細胞增殖的影響采用阿爾瑪藍測定法進行檢測,簡言之,將軟骨細胞接種至96孔板并培養(yǎng)48h,將阿爾瑪藍以10％的體積百分比加至培養(yǎng)基中并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h,采用分光光度計測量590nm時的吸光度。

15、>　　 (2)、與軟骨細胞增殖、分化相關因子的檢測。
　　 將不同濃度(0,0.1,1,10和100μg/ml)的褪黑素加到培養(yǎng)基里對軟骨細胞進行刺激。采用Western blot法檢測PCNA(反映細胞的增殖潛能)、Sox9(控制細胞分化的核心轉(zhuǎn)錄因子)、Smad4(調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖、分化的共同調(diào)節(jié)子)蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.大鼠椎體生長板軟骨細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　 (1)、大鼠

16、椎體生長板軟骨細胞的分離與培養(yǎng):
　　 1周齡SD大鼠的椎體生長板約2mm×1mm×0.5mm大小。軟骨細胞接種6h后開始貼壁,接種24h后所有細胞貼壁完成,細胞長滿后呈“鋪路石”狀外觀。MTT比色法顯示,傳3代以前的軟骨細胞的生長曲線近似“S”形,從第4天開始細胞呈對數(shù)生長,第9天達平臺期,至第11天開始出現(xiàn)生長抑制。
　　 (2)、大鼠椎體生長板軟骨細胞的鑒定:
　　 倒置相差顯微鏡下觀察和HE染色顯示細胞基

17、本形態(tài)為多邊形,胞漿豐富,胞核較圓；甲苯胺藍染色見胞核藍染；以上的描述均符合軟骨細胞的形態(tài)特征。
　　 (3)、軟骨細胞傳代特征的觀察:
　　 體外培養(yǎng)的軟骨細胞隨著傳代次數(shù)的增加,細胞形態(tài)由原代的多角形逐漸變?yōu)殚L梭形,傳4代后細胞有成纖維化的趨勢。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色示傳3代以前的軟骨細胞呈強陽性,隨著傳代次數(shù)的增加軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達逐漸降低。
　　 2.不同年齡大鼠胸椎椎體生長板的組織學觀察及增殖能力

18、測定
　　 (1)、番紅O-固綠染色。
　　 1天、1周、4周、8周、16周、28周齡大鼠椎體生長板番紅O-固綠染色可見生長板軟骨組織被染成紅色。16周大鼠椎體生長板靜止區(qū)內(nèi)開始有骨長入,28周齡大鼠椎體生長板仍然存在但靜止區(qū)大部分出現(xiàn)骨化現(xiàn)象。
　　 (2)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長板各區(qū)高度的測量。
　　 1天及1周大鼠肥大區(qū)明顯高于其他年齡組(P<0.01)；1天及1周大鼠增殖區(qū)高于其他年齡組(P<

19、0.05),4周大鼠增殖區(qū)高于28周大鼠(P<0.05)；1天及1周大鼠靜止區(qū)高于其他年齡組(P<0.05),4周大鼠靜止區(qū)高于16周、28周大鼠(P<0.05)。
　　 (3)、不同年齡大鼠胸椎椎體生長板的增殖能力測定。
　　 PCNA基因的相對表達量隨年齡增加而降低；與1天大鼠相比,剩余各組PCNA基因的表達與之的差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。PCNA蛋白的相對表達量隨年齡增加而減少；與1天大鼠相比,剩余各

20、組PCNA蛋白的表達與之的差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 3.大鼠椎體生長板褪黑素受體的測定
　　 (1)、免疫細胞化學染色測定生長板軟骨細胞褪黑素受體。
　　 大鼠椎體生長板軟骨細胞褪黑素受體免疫細胞化學染色顯示軟骨細胞被染成棕黃色。
　　 (2)、免疫組織化學染色測定大鼠椎體生長板褪黑素受體。
　　 1天大鼠椎體生長板褪黑素受體免疫組化染色示生長板各層內(nèi)軟骨細胞均被染成棕黃色。

21、
　　 (3)、褪黑素受體基因的測定。
　　 與內(nèi)參基因GAPDH相比,褪黑素受體(MT1,MT2)在椎體生長板軟骨細胞中的基因相對表達量分別為0.11±0.02、0.05±0.01。
　　 (4)、褪黑素受體蛋白的測定。
　　 與內(nèi)參β-actin相比,褪黑素受體(MT1,MT2)的蛋白相對表達量分別為0.28±0.11、0.22±0.09。
　　 4.褪黑素對體外培養(yǎng)生長板軟骨細胞增殖、分化影

22、響的檢測
　　 (1)、褪黑素對體外培養(yǎng)生長板軟骨細胞增殖影響的檢測。
　　 10和100μg/ml的褪黑素顯著抑制傳代椎體生長板軟骨細胞的增殖；褪黑素的溶劑(乙醇)對細胞的增殖無明顯影響；褪黑素的增殖抑制效應可被褪黑素受體拮抗劑luzindole拮抗。
　　 (2)、與軟骨細胞增殖、分化相關因子的檢測。
　　 隨著褪黑素濃度增高,PCNA、Sox9和Smad4的表達水平降低。
　　 結(jié)論:

23、>　　 1.改良序貫酶消化法能成功分離和培養(yǎng)大鼠椎體生長板軟骨細胞,能在短時間內(nèi)獲得高純度的軟骨細胞,傳3代及3代以內(nèi)的細胞具有軟骨細胞的特征性表型,增殖較快。
　　 2.1天及1周大鼠椎體生長板各區(qū)的高度明顯高于年齡較大的大鼠。16周大鼠椎體生長板靜止區(qū)內(nèi)開始有骨長入,28周齡大鼠椎體生長板仍然存在但靜止區(qū)大部分出現(xiàn)骨化現(xiàn)象。隨年齡增加椎體生長板軟骨細胞的增殖能力逐漸下降。
　　 3.大鼠椎體生長板存在褪黑素受體(M