ERα和ERβ在調(diào)控青少年椎體生長板軟骨細(xì)胞分化和增殖中的相互作用.pdf

1、目的:
　　初步探索ERα和ERβ基因在青春期椎體生長板軟骨細(xì)胞分化和增殖中相互作用，以及Smad4基因在ERα和ERβ調(diào)控軟骨細(xì)胞Runx2和BMP基因表達(dá)過程中的信號傳遞作用。
　　方法:
　　應(yīng)用genbank數(shù)據(jù)庫檢索小鼠ERα、ERβ和Smad4的cDNA序列及其轉(zhuǎn)錄本。設(shè)計針對ERα、ERβ和Smad4 mRNA打靶的siRNA序列，構(gòu)建基因沉默慢病毒載體并包裝成為慢病毒顆粒。以小鼠椎體生長板軟骨細(xì)胞為對象

2、，首先分別轉(zhuǎn)染ERα-shRNA-PLL3.7、ERβ-shRNA-PLL3.7、ERα-shRNA-PLL3.7+ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒和空白對照組研究ERα和ERβ所在軟骨細(xì)胞的增殖、分化過程中的調(diào)控作用。然后采用分層設(shè)計的方法進(jìn)行分組，分別轉(zhuǎn)染目的基因RNAi載體，研究Smad4基因在椎板軟骨細(xì)胞中介導(dǎo)ERα和ERβ調(diào)控Runx和BMP基因的表達(dá)的作用。分析各組細(xì)胞周期;繪制各組細(xì)胞生長曲線;檢測各組細(xì)胞Run

3、x2、BMP2表達(dá)的變化。用SPSS16.0軟件分析各組差異，P＜0.05為有顯著性。
　　結(jié)果:
　　(1)經(jīng)檢測證明，ERα-shRNA-PLL3.7、ERβ-shRNA-PLL3.7、Smad4-shRNA-PLL3.7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后相應(yīng)目的基因表達(dá)明顯減弱，均有顯著性差異，P＜0.05。
　　(2)轉(zhuǎn)染后第3、5、7、9天時，4組細(xì)胞吸光度值(A490)由高到低依次為ERβRNAi組＞空白對照組＞ERαRNAi組＞

4、聯(lián)合沉默組，且各組間有顯著性差異，P＜0.05。4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第3天經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示處于S期和G2期細(xì)胞百分率由高到低依次為:ERβRNAi組＞空白對照組＞ERαRNAi組＞聯(lián)合沉默組，且各組間有顯著性差異，P＜0.05。4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第10天，用Realtime-PCR檢測Runx2、BMP2基因表達(dá)相對于空白對照組改變的倍數(shù)由高到低依次為ERβRNAi組＞空白對照組＞ERαRNAi組＞聯(lián)合沉默組，且各組間有顯著性差異，P＜

5、0.05。
　　(3)采用分層設(shè)計進(jìn)一步檢測10個亞組細(xì)胞吸光度值(A490)并繪制生長曲線，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后第1天時，各組細(xì)胞比較均沒有顯著性差異，P＞0.05;但是于轉(zhuǎn)染后第3、5、7、9天時，10個亞組間的差異由高到低依次為ERβRNAi-ERα激動-Smad4正常紐＞ERβRNAi-ERα激動-Smad4RNAi組＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4正常細(xì)＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi組＞ERs正常-

6、Smad4正常組＞ERs正常-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4正常組＞ERαRNAi-ERβ正常-Smad4正常組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ正常-Smad4RNAi組，且除ERβRNAi-ERα激動-Smad4RNAi組與ERβRNAi-ERα激動-Smad4正常組比較，以及ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi組與ERβRNAi-ERα正常-Smad4

7、正常組比較沒有顯著性差異，P＞0.05以外，其它各組間比較均有顯著性差異，P＜0.05。各組間Runx2基因表達(dá)相對于空白對照組改變的倍數(shù)由高到低的順序與細(xì)胞生長曲線基本相同。而BMP2基因表達(dá)由高到低的順序為ERβRNAi-ERα激動-Smad4正常組＞ERβRNAi-ERα激動-Smad4RNAi組＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4正常組＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi組＞ERs正常-Smad4正常組＞ERs正

8、常-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4正常組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ正常-Smad4正常組＞ ERαRNAi-ERβ正常-Smad4RNAi組，然而，無論ERαRNAi組還是ERβRNAi組中，Smad4RNAi亞組與Smad4正常亞組比較，BMP2基因表達(dá)均沒有顯著性差異，P＞0.05。
　　結(jié)論:
　　ERα和ERβ均具有調(diào)控椎體生長板軟骨細(xì)胞分