Th17相關(guān)細(xì)胞因子在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎中的作用.pdf

1、研究目的
　　 格林-巴利綜合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是一種常見(jiàn)的外周神經(jīng)自身免疫性疾病,其病理特點(diǎn)為周?chē)窠?jīng)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘改變,具體病因和發(fā)病機(jī)制尚不十清楚。實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎(experimentalautoimmuneneuritis,EAN)是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的外周神經(jīng)自身免疫性脫髓鞘疾病,被公認(rèn)為研究GBS的理想動(dòng)物模型。
　　 Th17細(xì)胞是最近研究發(fā)現(xiàn)的新的輔

2、助T細(xì)胞亞群,其各種特性與Th1和Th2細(xì)胞不同,可以產(chǎn)生白細(xì)胞介素17(IL-17)、白細(xì)胞介素17F(IL-17F)、白細(xì)胞介素22(IL-22)等細(xì)胞因子。IL-17為其特征性效應(yīng)細(xì)胞因子,具有強(qiáng)烈的致炎作用,白細(xì)胞介素23(IL-23)作為新發(fā)現(xiàn)的促炎性細(xì)胞因子,在Th17細(xì)胞的擴(kuò)增與維持中發(fā)揮重要作用。目前研究證實(shí),Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病(IBD)、系統(tǒng)

3、性紅斑狼瘡(SLE)等發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用,其是否與EAN發(fā)病有關(guān),目前尚不清楚。
　　 本研究通過(guò)建立EAN大鼠作為GBS的動(dòng)物模型,檢測(cè)EAN大鼠坐骨神經(jīng)中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17和IL-23蛋白及mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá),探討Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23在在EAN發(fā)病中的作用及其機(jī)制,以期為自身免疫性疾病的治療提供新靶點(diǎn)。
　　 研究方法
　　 1.抗原制備:采用超速離心法自牛脊神

4、經(jīng)根提取周?chē)窠?jīng)髓磷脂(boyineperipheralnervemyelin,BPM)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:7-8周齡雌性L(fǎng)ewis大鼠32只,體重160-180g,隨機(jī)分為EAN組(n=24)和對(duì)照組(n=8)。EAN組又隨機(jī)分為免疫后9d(疾病早期組)、15d(疾病高峰期組)、21d(疾病恢復(fù)期組),每組8只。SPF級(jí)飼養(yǎng)。
　　 3.EAN模型的建立及臨床評(píng)分:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,10％水合氯醛(300mg/K

5、g)麻醉。將100μL抗原乳劑(含BPM5mg、結(jié)核桿菌1mg、不完全弗氏佐劑50μL、生理鹽水50μL)注入EAN各組大鼠雙側(cè)后肢足墊皮下。對(duì)照組每只注射等量弗氏不完全佐劑和結(jié)核桿菌。于免疫前即時(shí)及免疫后每日進(jìn)行臨床評(píng)估,直至免疫后21天。臨床評(píng)分:0:正常；0.5:全尾肌張力下降；1.0:尾部肌肉癱,松軟拖地；1.5:輕微后肢無(wú)力,肌張力下降；2.0:明顯后肢無(wú)力或輕度后肢癱；2.5:中度后肢癱；3.0:嚴(yán)重后肢癱；4:嚴(yán)重四肢癱。

6、
　　 4.動(dòng)物標(biāo)本取材:觀察大鼠的發(fā)病情況,分別在免疫后第9天,第15天,第21天處死EAN大鼠,對(duì)照組大鼠于第21天處死。無(wú)菌狀態(tài)下取雙側(cè)坐骨神經(jīng),一側(cè)坐骨神經(jīng)固定于4％多聚甲醛中,備做組織病理學(xué)和免疫組化檢測(cè)。另一側(cè)坐骨神經(jīng)存放于-80℃冰箱中,備做RT-PCR。
　　 5.組織病理學(xué)檢查:取4％多聚甲醛固定的坐骨神經(jīng),石蠟包埋,縱行切片(5-6μm,每根神經(jīng)2張連續(xù)切片),HE染色,觀察大鼠坐骨神經(jīng)中病理學(xué)變化。

7、
　　 6.免疫組化檢測(cè):大鼠坐骨神經(jīng)石蠟切片,常規(guī)脫蠟致水,經(jīng)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、抗原修復(fù)、牛血清白蛋白封閉處理,分別滴加一抗(兔抗大鼠IL-17、IL-23多克隆抗體)和二抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG),DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封固。40倍物鏡下采集圖像,觀察大鼠坐骨神經(jīng)中細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng),結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/高倍視野表示。
　　 7.RT-PCR檢測(cè):取各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)50mg,按照Trizol試劑盒

8、說(shuō)明書(shū)提取總RNA,采用紫外分光光度法定量,取1μg總RNA用M-MLV合成cDNA。以B-actin為內(nèi)參照分別擴(kuò)增IL-17和IL-23。采用BioRad公司的圖形分析軟件QuantityOne對(duì)RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度掃描,以條帶的平均吸光度和條帶面積的乘積代表信號(hào)強(qiáng)度,分別計(jì)算各例IL-17/B-actin和IL-23/β-actin值。
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以x±s表示。

9、應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則用SNK法或Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。
　　 結(jié)果
　　 1.EAN大鼠于免疫后9d開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀,15d到達(dá)疾病高峰,第21d基本完全恢復(fù),各組臨床評(píng)分與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。
　　 2.EAN大鼠坐骨神經(jīng)中IL-17蛋白及mRNA在免疫后第15天表達(dá)均達(dá)到最高點(diǎn),以后逐漸下降,且各組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。