來氟米特對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎防治作用的研究.pdf

1、 目的：觀察來氟米特(LEF)對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(EAE)的防治作用。探討LEF對EAE防治作用的免疫學機制。方法：將60只雌性Wistar大鼠隨機分成5組：空白對照組、EAE對照組及小、中、大劑量LEF防治組,每組12只。使用粗制髓鞘堿性蛋白(MBP)及完全弗氏佐劑制成免疫抗原,皮下注射制作 EAE 模型,空白對照組僅注射等量完全弗氏佐劑。自造模之日前三天起,小、中、大劑量LEF防治組分別予以LEF0.5mg/kg/d、2m

2、g/kg/d、8mg/kg/d灌胃,空白對照組及EAE對照組每日以生理鹽水2ml灌胃,連續(xù)10天。記錄Wistar大鼠發(fā)病率、發(fā)病潛伏期、進展期及發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分。在發(fā)病高峰期時處死大鼠,未發(fā)病及空白對照組4周后處死。留取大鼠腦脊髓組織、胸腺及眶靜脈血。大鼠腦脊髓組織處理后做HE 染色,通過酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA )測定外周血單個核細胞(PBMC)分泌 IL-4 及 IFN-γ水平,通過放射免疫法檢測腦組織細胞因子IL-

3、2、IL-6、TNF-α含量,通過流式細胞儀測定外周血T細胞亞群分布以及胸腺細胞凋亡率。結果：(1)Wistar大鼠發(fā)病情況：空白對照組大鼠未發(fā)?。籈AE 對照組發(fā)病率 100%；小、中、大劑量LEF防治組部分動物發(fā)病,發(fā)病率分別為83.33%、66.67%、58.33%。EAE對照組發(fā)病潛伏期11.00±1.28天,小、中、大劑量LEF防治組發(fā)病潛伏期分別為17.10±0.88天、20.63±1.06天、22.71±0.95天, LE

4、F 各防治組發(fā)病潛伏期均比 EAE 對照組長(P<0.01),劑量依賴關系明顯。EAE 對照組發(fā)病進展期 6.83±0.72 天,小、中、大劑量LEF防治組發(fā)病進展期分別為5.20±0.79天、4.00±0.76天、3.00± 0.82天,LEF各防治組發(fā)病進展期均比EAE對照組縮短(P<0.01),呈劑量依賴關系。EAE 對照組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分為 4.00 ±1.54 分,小、中、大劑量 LEF 防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙

5、評分為2.67±1.83、1.83±1.80分、1.17±1.34分,大、中劑量LEF防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分較EAE對照組評分低(P<0.01),小劑量LEF防治組與EAE對照組相比差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；大劑量 LEF 防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分較小劑量LEF防治組低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),中劑量LEF防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分較小劑量 LEF 防治組低,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05

6、)；大劑量LEF防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分較中劑量LEF防治組低,但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(2) EAE對照組及小、中、大劑量LEF防治組Wistar大鼠腦及脊髓病理學改變情況：空白對照組大鼠腦組織無異常。EAE對照組及LEF各防治組大鼠腦組織實質內血管周圍有大量炎性細胞浸潤,其中以淋巴細胞浸潤為主同時伴有少量的單核細胞,典型者形成“袖套”樣的改變。LEF各防治組炎性細胞浸潤嚴重程度與EAE對照組相比病理改變減輕,

7、且劑量越大減輕程度越明顯。(3)LEF對EAE大鼠發(fā)病高峰期腦組織中 IL-2、IL-6、TNF-α含量的影響：EAE 對照組發(fā)病高峰期腦組織中IL-2、IL-6、TNF-α含量較空白對照組明顯增高(P<0.01),LEF 各防治組發(fā)病高峰期腦組織 IL-2、IL-6、TNF-α 含量較EAE 對照組明顯降低(P<0.01),大、中劑量 LEF 防治組大鼠發(fā)病高峰期腦組織IL-2、IL-6、TNF-α含量較小劑量LEF防治組組降低(P<

8、0.01),大劑量 LEF 防治組發(fā)病高峰期腦組織 IL-2、IL-6、TNF-α含量較中劑量LEF防治組降低(P<0.01)。(4)EAE對照組及LEF各防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4及INF-γ能力及其比值：EAE對照組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值較空白對照組降低(P<0.01),分泌 INF-γ 能力較空白對照組增強(P<0.01)；LEF各防治組PBMC分泌IL-4能力、IL-4/IN

9、F-γ值較EAE對照組明顯增高(P<0.01),分泌INF-γ能力較EAE對照組明顯降低(P<0.01)；大、中劑量LEF防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值較小劑量LEF防治組明顯增高(P<0.01或P<0.05),分泌 INF-γ 能力較小劑量 LEF 防治組降低(P<0.01)；大劑量 LEF防治組大鼠發(fā)病高峰期PBMC分泌IL-4能力、IL-4/INF-γ值較中劑量LEF組明顯增高(P<0.01)

10、,分泌INF-γ能力較中劑量LEF防治組降低(P<0.01)。(5)EAE對照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期T細胞亞群的分布變化：EAE組發(fā)病高峰期外周血T細胞亞群CD4+、CD8+分布比例較空白對照組明顯降低(P<0.01),CD4+/CD8+值明顯增高(P<0.01)；LEF各防治組發(fā)病高峰期期外周血CD4+、CD8+分布比例較EAE對照組明顯增高(P<0.01),CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.01)；大、中劑量LEF防治組大

11、鼠發(fā)病高峰期外周血CD4+、CD8+分布比例較小劑量 LEF 組明顯增高(P<0.01),CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.01),大劑量LEF防治組發(fā)病高峰外周血CD4+、CD8+分布比例較中劑量LEF組明顯增高(P<0.01),CD4+/CD8+值降低不明顯(P>0.05)。(6)EAE對照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期胸腺細胞凋亡率變化：EAE 對照組胸腺細胞凋亡率較正常對照組明顯增高(P<0.01),LEF各防治組發(fā)病高峰期胸

12、腺細胞凋亡率較EAE對照組降低 (P<0.01)；大、中劑量LEF防治組胸腺細胞凋亡率較小劑量LEF防治組低(P<0.01),大劑量LEF防治組胸腺細胞凋亡率較中劑量LEF防治組低(P<0.01)。(7)相關性分析：EAE對照組及LEF各防治組發(fā)病潛伏期與發(fā)病高峰期 IL-2、IL-6、TNF-α、CD4+/CD8+及胸腺細胞凋亡呈負相關(P<0.01或P<0.05),與IL-4/INF-γ值呈正相關(P<0.01或P<0.05)；EA

13、E對照組及LEF各防治組發(fā)病進展期與發(fā)病高峰期IL-2、IL-6、TNF-α、CD4+/CD8+及胸腺細胞凋亡呈正相關(P<0.01或P<0.05),與IL-4/INF-γ值呈負相關(P<0.01或P<0.05)；EAE對照組及 LEF 各防治組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分與發(fā)病高峰期 IL-2、IL-6、TNF-α、CD4+/CD8+及胸腺細胞凋亡呈正相關(P<0.01或P<0.05),與IL-4/INF-γ值呈負相關(P<0.01或P

14、<0.05)。結論：1. Wistar大鼠通過注入豚鼠脊髓勻漿可以成功制作EAE模型。2.EAE大鼠高峰期腦組織炎性細胞因子產(chǎn)生增多,Th1/Th2比例失衡,Th0分化向Th1漂移,T淋巴細胞亞群分布異常,胸腺細胞凋亡異常。3. LEF可以降低 EAE 大鼠發(fā)病率,延長其發(fā)病潛伏期、縮短進展期,同時減輕高峰期臨床癥狀、減輕腦脊髓炎癥細胞浸潤,LEF對EAE大鼠發(fā)病具有防治作用。4.LEF 通過抑制 EAE 大鼠炎性細胞因子產(chǎn)生、糾正Th