促紅細胞生成素治療小鼠實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的觀察.pdf

1、第一部分:促紅細胞生成素治療小鼠實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎
　　目的:觀察促紅細胞生成素(crytbxopoietin,EPO)對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)小鼠模型治療效果。
　　方法:將EAE小鼠隨機分為PBS對照組(EAEcontrol)、預(yù)防性EPO干預(yù)組(EPOpremorbid)以及治療性EPO干預(yù)組(EPOpostmorbi

2、d),觀察EAE臨床癥狀和體重變化;HE染色觀察脊髓炎性細胞浸潤,應(yīng)用流式細胞儀觀察腦和脊髓細胞亞群以及相關(guān)細胞因子。
　　結(jié)果:同EAEcontrol相比,EPOpremorbid和EPOpostmorbid組小鼠起病時間較晚,臨床癥狀較輕,腰骶部脊髓浸潤細胞較少(P＜0.05);EPOpremorbid浸潤細胞中CD4+T細胞、IL-17+CD4+T細胞以及IFNI-γ+CD4+T細胞比例均顯著低于EAEeontrol(P＜0

3、.05)。
　　結(jié)論:EPO可改善EAE小鼠臨床癥狀,減少病灶浸潤炎性細胞以及炎性因子。
　　第二部分:促紅細胞生成素受體表達
　　目的:觀察EPO受體在外周免疫細胞和中樞膠質(zhì)細胞上的表達。
　　方法:從EAE脾臟和外周淋巴結(jié)中提取單個核細胞,并進一步純化提取CD4+T細胞;培養(yǎng)并鑒定原代星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞;應(yīng)用RT-PCR觀察EPO受體的表達。
　　結(jié)果:在外周,EPO受體可表達在單個核細胞,但不表

4、達在CD4+T細胞;在中樞,EPO受體均可表達在靜息態(tài)和LPS激活態(tài)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。
　　結(jié)論:EPO受體在外周免疫細胞和中樞膠質(zhì)細胞上均有表達。
　　第三部分:EPO對外周單個核細胞免疫功能的影響
　　目的:探討EPO是否可通過對外周免疫細胞的作用而實現(xiàn)對炎性細胞功能的抑制。
　　方法:應(yīng)用流式細胞儀觀察,EAEcontrol和EPOpremorbid組外周單個核細胞(Mononuclear cel

5、ls,MNC和MNCe)亞群以及MHC-Ⅱ和細胞因子表達;植物血球凝集素(PHA)或MOG35-55抗原刺激外周免疫細胞后,MTT法觀察細胞增殖,同時應(yīng)用ELISA和RT-PCR觀察細胞因子變化。
　　結(jié)果:MNCe中CD4+T細胞、IL-17+CD4+T細胞和(或)IFN-γ+CD4+T細胞、MHC-Ⅱ比例均顯著低于MNC(P＜0.05):PHA非特異性刺激后,MNCe的IL-17、IL-23、IL-6和IFN-γ低于MNC(P

6、＜0.05),而兩者的增殖率無顯著差異(P＞0.05);EPO和MOG35-55抗原共同處理后MNC所產(chǎn)生的IL-17、IFN-γ、IL-23低于單獨用MOG35-55抗原刺激后MNC(P＜0.05);EPO和MOG35-55抗原共同處理后CD4+T細胞所產(chǎn)生的IFN-γ低于單獨用MOG35-55抗原刺激后CD4+T細胞(P＜0.01)。
　　結(jié)論:EPO可以抑制外周單個核細胞IL-17和IFN-γ等炎性因子分泌,其機制可能同下調(diào)

7、IL-23和MHC-Ⅱ水平有關(guān)。
　　第四部分:EPO對星形膠質(zhì)細胞與EAE免疫細胞相互作用的影響
　　目的:探討EPO可否通過對星形膠質(zhì)細胞作用,影響它們同EAE小鼠外周免疫細胞的相互作用。
　　方法:EPO處理靜息態(tài)和LPS/IFN-γ激活態(tài)星形膠質(zhì)細胞后,應(yīng)用ELISA和RT-PCR等方法,觀察細胞因子變化;MTT法觀察星形膠質(zhì)細胞增殖;利用細胞免疫化學(xué)和流式細胞儀,觀察MHC-Ⅱ表達水平的差異。EPO處理前后,

8、靜息態(tài)和LPS/IFN-γ激活態(tài)星形膠質(zhì)細胞,分別以1:1或1:5比例同MNC和CD4+T細胞共培養(yǎng),應(yīng)用ELISA觀察細胞因子分泌,流式細胞儀觀察MHC-Ⅱ表達。
　　結(jié)果:1)EPO抑制靜息態(tài)星形膠質(zhì)細胞IL-6和LPS激活態(tài)星形膠質(zhì)細胞IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-23以及MHC-Ⅱ表達(P＜0.05);2)EPO可促星形膠質(zhì)細胞增殖以及一氧化氮(nitricoxide,NO)釋放;3)靜息態(tài)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)EPO處

9、理后,可使其與MNC以1:1比例共培養(yǎng)中IFN-γ、IL-10和IL-6降低(P＜0.05),與MNC以1:5比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-17以及IL-23降低(P＜0.05);4)激活態(tài)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)EPO處理后,可使其與CD4+T細胞以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-23降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:EPO促進靜息星形膠質(zhì)細胞增殖和NO釋放,抑制LPS/IFN-γ激活態(tài)星形膠質(zhì)細胞MH

10、C-Ⅱ以及IL-17、IL-23和IL-27表達。EPO預(yù)處理的星形膠質(zhì)細胞可在與免疫細胞共培養(yǎng)中抑制IL-17或(和)IFN-γ,其機制可能同下調(diào)MHC-Ⅱ和(或)IL-23等有關(guān)。
　　第五部分:EPO對小膠質(zhì)細胞與EAE免疫細胞相互作用的影響
　　目的:探討EPO可否通過對小膠質(zhì)細胞作用,影響它們同EAE小鼠免疫細胞的相互作用。
　　方法:EPO處理靜息態(tài)和LPS/IFN吖激活態(tài)小膠質(zhì)細胞后,應(yīng)用ELISA和RT

11、-PCR等方法,觀察細胞因子變化;LDH測定觀察小膠質(zhì)細胞死亡;利用細胞免疫化學(xué)和流式細胞儀,觀察MHC-Ⅱ表達水平的差異。EPO處理前后,靜息態(tài)和LPS/IFN-γ激活態(tài)小膠質(zhì)細胞,分別以1:1或1:5比例同MNC和CD4+T細胞共培養(yǎng),應(yīng)用ELISA觀察細胞因子分泌,流式細胞儀觀察MHC-Ⅱ表達。
　　結(jié)果:1)EPO抑制激活態(tài)小膠質(zhì)細胞IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-23以及MHC-Ⅱ表達(P＜0.05);2)EPO

12、可抑制小膠質(zhì)細胞死亡;3)靜息態(tài)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)EPO處理后,可使其與CD4+T細胞以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IL-17、IL-23降低(P＜0.05),與CD4+T細胞以1:5比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-23降低(P＜0.05),與MNC以1:1比例共培養(yǎng)中IFN-γ降低,IL-10升高(P＜0.05);4)激活態(tài)小膠質(zhì)細胞經(jīng)EPO處理后,可使其與CD4+T細胞以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ、IL-23降低(P

13、＜0.05),與MNC以1:1比例共培養(yǎng)中IL-6、IFN-γ降低(P＜0.05);5)與MNC共培養(yǎng)的靜息態(tài)小膠質(zhì)細胞,MHC-Ⅱ表達上調(diào)(P＜0.05),若小膠質(zhì)細胞經(jīng)EPO預(yù)處理,則MHC-Ⅱ表達可被抑制(P＜0.05)。
　　結(jié)論:EPO抑制靜息態(tài)小膠質(zhì)細胞死亡,抑制LPS/IFN-γ激活態(tài)小膠質(zhì)細胞MHC-Ⅱ表達以及IL-17、IL-23、IL-27產(chǎn)生。EPO對靜息或激活態(tài)小膠質(zhì)細胞的預(yù)處理,使得其與免疫細胞共培養(yǎng)中I

14、L-17和(或)IFN-γ降低,其機制可能同下調(diào)IL-23和MHC-Ⅱ表達有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.EPO可減輕EAE病灶炎性細胞浸潤,改善臨床癥狀。
　　2.外周單個核細胞和中樞膠質(zhì)細胞上均有EPO受體表達,EPO可直接作用于這些細胞,但CD4+T細胞并不表達EPO受體。
　　3.激活態(tài)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞可表達MHC-Ⅱ,同時有IL-17、IL-23和IL-27產(chǎn)生,而EPO則可抑制這些功能分子的表達。