骨橋蛋白在實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的:探討骨橋蛋白(osteopontin,OPN)在實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)大鼠發(fā)病中的作用及其免疫學機制,探討阿托伐他汀對EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervoussystem,CNS)OPN表達的影響以及對EAE的治療作用。方法:將40只雌性Wistar大鼠隨機分成4組:正常對照組、EAE對照組、大劑量阿托伐他汀組和小劑量阿托伐他

2、汀組,每組各10只。采用粗制髓鞘堿性蛋白(myelinbasic protein,MBP)抗原注入EAE對照組及大、小劑量阿托伐他汀組大鼠后足掌皮下(0.2ml/100g)制作EAE模型,正常對照組注射等量生理鹽水。自造模之日開始,小劑量阿托伐他汀組每日灌胃阿托伐他汀1mg/kg.d,大劑量阿托伐他汀組每日灌胃阿托伐他汀4mg/kg.d,正常對照組及EAE對照組每日灌胃等體積生理鹽水,直至整個實驗結束。EAE對照組、大小劑量阿托伐他汀組

3、連續(xù)3天癥狀評分無加重或四肢癱瘓、死亡時作為EAE發(fā)病高峰期。記錄發(fā)病大鼠的潛伏期、進展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評分；于發(fā)病高峰期處死大鼠,正常對照組4周后處死,留取大鼠腦及脊髓組織,經(jīng)處理切片行HE染色,光學顯微鏡下觀察病理變化；免疫組化技術和平均光密度測定法檢測各組大鼠腦和脊髓白質(zhì)組織內(nèi)OPN和CD44的表達情況；留取各組大鼠眶靜脈血,用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢

4、測外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分泌IFN-γ、IL-10的能力。結果:(1)大鼠發(fā)病情況:正常對照組大鼠未發(fā)病。EAE對照組及大、小劑量阿托伐他汀組均有不同程度發(fā)病。EAE對照組發(fā)病潛伏期為12.5±1.1天,小劑量阿托伐他汀組潛伏期(14.2±1.3天)較EAE對照組延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),大劑量阿托伐他汀組潛伏期(19.4±2.2天)較EAE對照組及

5、小劑量阿托伐他汀組均明顯延長(P<0.01,P<0.05)；EAE對照組發(fā)病進展期為6.9±1.4天,小劑量阿托伐他汀組進展期(4.7±0.6天)較EAE對照組縮短(P<0.01),大劑量阿托伐他汀組進展期(4.4±0.8天)較EAE對照組明顯縮短(P<0.01),而同小劑量阿托伐他汀組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；EAE對照組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分為3.6±0.5分,小劑量阿托伐他汀組神經(jīng)功能障礙評分(1.8±0.8分

6、)較EAE對照組明顯降低(P<0.01),大劑量阿托伐他汀組神經(jīng)功能障礙評分(1.6±0.8分)較EAE對照組明顯降低(P<0.01),而同小劑量阿托伐他汀組比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(2)EAE對照組、大小劑量阿托伐他汀組大鼠腦及脊髓病理學改變:正常對照組大鼠腦和脊髓無異常。EAE對照組大鼠高峰期可見腦及脊髓實質(zhì)內(nèi)小血管充血,血管周圍主要是小靜脈周圍有大量炎性細胞浸潤,主要為單個核細胞浸潤,形成“袖套”狀改變,血管周圍

7、白質(zhì)明顯脫髓鞘改變。而小劑量阿托伐他汀組病理改變較輕,大劑量組最輕。(3)EAE對照組、大小劑量阿托伐他汀組大鼠CNS內(nèi)OPN和CD44表達情況:OPN、CD44表達部位主要在大腦、腦干、脊髓白質(zhì)及灰白質(zhì)交界的小血管周圍。OPN主要分布在神經(jīng)細胞胞核,部分胞漿亦有表達；CD44主要分布在神經(jīng)細胞胞漿,兩者高表達部位的炎癥表現(xiàn)較重。正常對照組大鼠CNS內(nèi)未發(fā)現(xiàn)OPN、CD44陽性細胞；EAE對照組大鼠CNS白質(zhì)及灰白質(zhì)交界處可見大量陽性細

8、胞,棕黃色顆粒濃染,著色深；大劑量阿托伐他汀組和小劑量阿托伐他汀組大鼠CNS內(nèi)僅有少量散在淡染的陽性細胞,小劑量阿托伐他汀組CD44表達高于大劑量阿托伐他汀組。圖像分析結果顯示,與大劑量阿托伐他汀組及小劑量阿托伐他汀組比較,EAE對照組CNS白質(zhì)OPN、CD44表達水平均明顯升高(P<0.01)；與小劑量阿托伐他汀組比較,大劑量阿托伐他汀組CNS白質(zhì)的OPN、CD44表達水平顯著降低(P<0.05)。(4)EAE對照組、大小劑量阿托伐他

9、汀組大鼠PBMC分泌IFN-γ、IL-10能力:正常對照組PBMC分泌的IFN-γ水平為0.21±0.02ng/ml,EAE對照組分泌的IFN-γ水平為0.38±0.04ng/ml,EAE對照組較正常對照組明顯升高(P<0.01),大、小劑量阿托伐他汀組分泌的IFN-γ水平分別為0.24±0.01ng/ml、0.27±0.02ng/ml,均較EAE對照組顯著下降(P<0.01),大劑量阿托伐他汀組較小劑量阿托伐他汀組下降更明顯(P<0.

10、05)；正常對照組PBMC分泌的IL-10水平為2.25±0.28pg/ml,EAE對照組分泌的IL-10水平為2.91±0.39pg/ml,EAE對照組較正常對照組無明顯改變(P>0.05),大、小劑量阿托伐他汀組分泌的IL-10水平分別為7.05±1.46pg/ml、5.80±1.10pg/ml,均較EAE對照組顯著升高(P<0.01),大劑量阿托伐他汀組較小劑量阿托伐他汀組升高明顯(P<0.05)；EAE對照組IFN-γ/IL-1

11、0比值(105.54±15.85)較正常對照組(92.82±13.63)明顯升高(P<0.05),大、小劑量阿托伐他汀組IFN-γ/IL-10比值分別是31.13±9.69、47.06±7.51,均較EAE對照組顯著下降(P<0.01),大劑量阿托伐他汀組IFN-γ/IL-10比值較小劑量阿托伐他汀組顯著降低(P<0.05)。(5)相關性分析:EAE對照組及大小劑量阿托伐他汀組發(fā)病高峰期OPN、CD44表達與發(fā)病潛伏期呈負相關(P<0.

12、01),與發(fā)病進展期、高峰期神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(P<0.05)。EAE對照組及大小劑量阿托伐他汀組發(fā)病高峰期外周血IFN-γ/IL-10比值與發(fā)病潛伏期呈負相關(P<0.01),與發(fā)病進展期、神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(P<0.01)。EAE對照組及大小劑量阿托伐他汀組發(fā)病高峰期OPN、CD44表達與外周血IFN-γ/IL-10比值呈正相關(P<0.05)。EAE對照組及大小劑量阿托伐他汀組發(fā)病高峰期OPN與CD44表達呈相正關(P

13、<0.05)。結論:1.本實驗以豚鼠脊髓粗制MBP為免疫原誘導大鼠EAE模型,EAE大鼠神經(jīng)功能障礙明顯,腦和脊髓血管周圍炎性細胞浸潤、白質(zhì)脫髓鞘,說明本法造模成功,可靠,穩(wěn)定。2.EAE大鼠體內(nèi)存在著免疫失衡。EAE對照組大鼠發(fā)病高峰期體內(nèi)Th1型細胞因子IFN-γ增多,Th2型細胞因子IL-10減少,Th1/Th2細胞比例失衡,免疫格局向Th1型偏移。3.EAE大鼠發(fā)病期OPN表達上調(diào),OPN表達與EAE潛伏期呈負相關,與進展期、神