Tregs與Th17相關細胞因子在肌炎模型小鼠中表達的研究.pdf

1、特發(fā)性炎癥性肌病(IIM)是一組異質(zhì)性的急性、亞急性或慢性起病的罕見的獲得性骨骼肌炎性疾病。其臨床表現(xiàn)為肌肉無力,肌酸激酶升高,肌電圖非特異性異常等,常累及多臟器病變,病變嚴重時危及生命[1-3],目前其確切發(fā)病機制不清。根據(jù)臨床病理特征主要將其分為多發(fā)性肌炎(PM)、皮肌炎(DM)、包涵體肌炎(IBM)和免疫介導的壞死性肌炎(IMNM)。
　　由于多發(fā)性肌炎的發(fā)病機制不清,治療效果不理想,因此我們擬通過肌炎動物模型來進行研究。目

2、前較好的動物模型是肌漿球蛋白誘導的實驗性自身免疫性肌炎(EAM)模型,其在多個方面都與PM[4]相似,為我們研究IIM提供了良好的基礎。本研究中采用的模型為我們前期通過改變肌球蛋白注射劑量和注射輔劑的時間得到的改良EAM模型,其特點為用時短、重復性強、穩(wěn)定可靠。我們前期的研究中觀察EAM模型2個月,發(fā)現(xiàn)炎癥逐步加重,在14天時炎癥最嚴重,然后炎癥稍有減弱,28天后基本成穩(wěn)定的炎癥狀態(tài),因此我們選擇0天、14天和28天3個時間點來進行實驗

3、。
　　大量的報道證實,Tregs和Th17細胞之間的失衡與多種自身免疫性疾病有關[5-7]。Tregs是在自身免疫性疾病中的起保護作用的細胞,Th17細胞通過誘導各種促炎反應增強自身免疫反應的進展。但這些研究都沒有闡明PM中,Tregs和Th17細胞之間到底如何變化?故本研究通過觀察Tregs和Th17相關的細胞因子的變化情況,嘗試發(fā)現(xiàn)這些因子在肌炎發(fā)病過程中的可能作用。
　　目的
　　觀察Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Fox

4、p3及相關的細胞因子(IL-10、TGF-β)和Th17相關的細胞因子(IL-6、IL-17、IL-23)在EAM發(fā)病過程中的變化規(guī)律,探討這些因子在肌炎中的可能作用以及這些因子與兩種細胞的相關性,從而嘗試找出調(diào)節(jié)兩種細胞變化的關鍵因子。
　　方法
　　將健康成年雌性BALB/c小鼠(體重15~18g,5~6周齡)隨機分為3組,每組5只:第一組為0天處理組(正常組),第二組為EAM14天處理組,第三組為EAM28天處理組。進

5、行肌力測定和組織病理學評分;采用實時熒光定量PCR檢測小鼠肌肉和脾臟中Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關的細胞因子(IL-10、TGF-β)和Th17相關的細胞因子(IL-6、IL-17、IL-23)mRNA的表達水平;采用Luminex液相芯片技術檢測小鼠血清中IL-6,IL-17和TGF-β1的表達水平。
　　結(jié)果
　　1.0天處理組小鼠肌力均超過30分鐘,EAM處理組小鼠肌力均明顯下降,以EAM14天處理組肌力下降最

6、明顯,三組間均有統(tǒng)計學差異(P<0.01);組織病理學評分:0天處理組0分,EAM14天處理組3.05±0.190分,EAM28天處理組1.85±0.105分,在14天時炎癥最為嚴重,28天時略有好轉(zhuǎn)(P<0.01)。通過光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),0天處理組小鼠的肌纖維是多角形,大小基本一致,細胞核多位于肌纖維周邊,I型(深染)與II型(淺染)肌纖維清晰可見;EAM14天處理組小鼠的肌纖維大量炎癥細胞浸潤,肌纖維大小不等,可見散在分布的壞死、再生

7、纖維;EAM28天處理組小鼠的肌纖維炎癥程度稍減輕,但仍有較多炎癥細胞浸潤。
　　2.在小鼠肌肉組織的mRNA中,Tregs相關的細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在0天時表達較低(0.697±0.322),在14天時略有升高(1.274±0.547),在28天時顯著增加(16.491±7.884);IL-10在0天時表達較低(1.010±0.479),在14天時顯著增加(5.670±2.979),28天時下降(2.648±0.633);TG

8、F-β在0天時表達較高(0.576±0.250),在14天時有所下降(0.358±0.186),在28天時顯著降低(0.094±0.075)。Th17相關的細胞因子IL-6、IL-17和IL-23變化規(guī)律從0→14→28天都為持續(xù)上升趨勢,28天增高最為顯著(IL-6:0.459±0.308,0.636±0.113,1.477±0.224;IL-17:0.718±0.208,2.197±0.295,19.237±2.126;IL-23:

9、0.754±0.296,2.035±1.050,20.158±11.188)。
　　3.在小鼠脾臟組織的mRNA中,Tregs相關的細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3從0→14→28天為持續(xù)增高,28天增高最顯著(0天:1.017±0.080;14天:1.908±0.675;28天:4.992±1.924)。相反,其相關的細胞因子IL-10和TGF-β則均為下降趨勢,14天時就下降顯著,28天繼續(xù)降低(IL-10:0.994±0.147,0.

10、223±0.057,0.183±0.043;TGF-β:0.697±0.188,0.063±0.104,0.063±0.058)。Th17相關的細胞因子IL-6在0天時表達較高(0.507±0.384),在14天時顯著下降(0.066±0.163),在28天時略有升高(0.167±0.069);IL-17在0天時表達較低(1.269±0.293),在14天時略有升高(2.681±0.305),在28天時顯著增加(10.252±1.672

11、);IL-23無明顯變化。
　　4.在小鼠血清中,IL-6,IL-17和TGF-β1的表達水平三者均為在0天時最低,14天時達到高峰,28天時有所下降,但仍高于0天,與肌肉組織的炎癥程度一致。(IL-6:0,35.840±3.094,3.740±1.108;IL-17:0,35.130±5.524,10.120±3.579;TGF-β1:2413.100±223.563,3861.600±317.621,2895.800±366.

12、154)。
　　結(jié)論
　　1.在EAM的發(fā)病過程中,Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關的細胞因子IL-10、TGF-β和Th17相關的細胞因子IL-6、IL-17、IL-23都有不同的顯著變化,總的趨勢為前者下降,后者增高,提示Tregs和Th17之間的失衡在肌炎發(fā)病機制中起重要作用。
　　2.在肌炎的14天升高的細胞因子有IL-10和IL-17,說明其在早期的炎癥反應時發(fā)揮重要作用;在28天時仍升高的細胞因子有IL

13、-6、IL-17、IL-23,說明這些細胞因子可能與炎癥的持續(xù)發(fā)展有關。
　　3.在肌炎發(fā)生發(fā)展過程中,小鼠脾臟中的IL-6、IL-10和TGF-β逐步降低,提示脾臟作為T淋巴細胞的增殖場所,調(diào)控體內(nèi)T淋巴細胞的分布,使T淋巴細胞經(jīng)過再循環(huán)后重新分布,使這些因子向肌肉炎癥部位歸巢,從而發(fā)揮其免疫作用,說明脾臟在肌炎的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
　　4.在肌肉組織炎癥發(fā)展過程中,IL-6逐步上升,TGF-β逐步下降,在14天時