轉(zhuǎn)錄因子DEAF1相關(guān)功能蛋白的篩選.pdf

1、目的:獲得轉(zhuǎn)錄因子DEAF1穩(wěn)定高表達的293T細胞株,通過免疫共沉淀(Co-IP)和質(zhì)譜分析技術(shù)篩選能與DEAF1相互作用的蛋白質(zhì)因子,以闡明 DEAF1在淋巴結(jié)中調(diào)控外周組織抗原基因表達的分子機制及外周免疫耐受建立、維持的機制,為1型糖尿病早期干預(yù)和治療提供新策略。
　　方法:(1)用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pEGFP-mDEAF1和pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染293T和2F-2B細胞株,經(jīng)24小時后,通過熒光顯微鏡觀察D

2、EAF1在2種細胞中的定位。(2)用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒p3×FLAG-mDEAF1分別轉(zhuǎn)染293T和2F-2B細胞株,同時設(shè)置相應(yīng)未轉(zhuǎn)染的空白對照組,經(jīng)24小時后,通過RT-PCR法和Real-time PCR法檢測DEAF1在2種細胞中mRNA表達水平,通過Western blot法檢測DEAF1在2種細胞中蛋白表達水平。(3)用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑將p3×FLAG-mDEAF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,經(jīng)48小時后,

3、用1000μg/ml的G418篩選陽性克隆,挑取單個陽性克隆擴大培養(yǎng),用Western blot、免疫熒光和FCM檢測鑒定DEAF1穩(wěn)定表達的293T細胞株(293T-DEAF1)。(4)抽提293T-DEAF1和正常293T細胞的核蛋白,用EZviewTM Red ANTI-FLAG M2親和珠子進行Co-IP,SDS-PAGE分離,挑選明顯富集和對照泳道沒有的條帶做質(zhì)譜分析,明確DEAF1的相關(guān)功能蛋白。
　　結(jié)果:(1)熒光

4、顯微鏡下可見DEAF1定位于細胞核。(2) RT-PCR、Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染組DEAF1的mRNA表達水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組,分別為P<0.05和P<0.01,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;Western blot法檢測轉(zhuǎn)染組有融合蛋白mDEAF1/FLAG表達。(3)成功獲得穩(wěn)定高表達DEAF1的293T細胞株。(4)經(jīng)Co-IP篩選和質(zhì)譜分析得到一些DEAF1的相關(guān)功能蛋白。
　　結(jié)論:成功獲得穩(wěn)定高表達DEAF1的293