ROS-NF-κB-COX-2在扇貝多肽保護UVB誘導的HaCaT細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：復制20mJ·cm-2UVB輻射損傷HaCaT角質(zhì)形成細胞的凋亡模型，從活性氧(ROS)、核因子-κB(NF-κB)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)信號通路探究扇貝多肽(polypeptid.fro.Chlamy.farreri,PCF)保護UVB誘導的HaCaT細胞凋亡的分子機制。 方法：建立20mJ·cm-.UVB照射HaCaT細胞后18h的最佳凋亡模型，根據(jù)實驗設計分為：對照組、UVB模型組、藥物組(5.68，2.84，

2、1.42mmol·L-1PCF)、抑制劑組(5mmol·L-.NAC，0.2μmol.L-.MG132，1μmol·L-.celecoxib)。Hochest33258熒光染色和瓊脂糖凝膠電泳法觀察UVB引起的細胞凋亡形態(tài)學及生物化學改變并分析PCF、ROS清除劑(NAC)、NF-κB抑制劑(MG132)及COX-2抑制劑(celecoxib)對細胞凋亡的影響；電子自旋共振技術(ESR)檢測1-48.ROS的動態(tài)釋放，免疫印跡法檢測胞漿

3、超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)，NF-κB/p65，p-NF-κB/p65，IκBα，p-IκBα和IKKα和COX-2的蛋白表達；RT-PCR檢測胞漿谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)，IκBα以及COX-.mRNA的表達；免疫熒光檢測NF-κB/p65的核定位；采用免疫共沉淀檢測IκBα與IKKα的相互作用。 結(jié)果：UVB輻射后HaCaT細胞出現(xiàn)核固縮等凋亡形態(tài)學改變，凋亡梯形條帶明顯增加；48h內(nèi)RO

4、S表達水平均高于對照組，并分別在3h和24h出現(xiàn)高峰，尤以3h表達最高(P<0.01)；抗氧化酶GPx，Cu，Zn-SOD和CAT的表達均明顯降低(P<0.01).NF-κB/p65移位于胞核使核內(nèi)表達增加同時磷酸化水平升高，IκBα表達減少而p-IκBα及IKKα達增加(P<0.01).IKKα與IκBα的結(jié)合作用增強，COX-2的表達水平增加(P<0.01)。1.42～5.6.mmol·L-1劑量范圍內(nèi)的PCF及相應的抑制劑組可明顯

5、抑制UVB引起的HaCaT細胞凋亡，減少DN.Ladder的形成(P<0.05）；同時提高細胞內(nèi)抗氧化酶GPx，Cu,Zn-SOD和CAT的表達(P<0.05)，抑制UVB誘導的HaCaT細胞內(nèi)NF-κB的激活、IκBα的磷酸化降解、IKKα的表達及IKKα與IκBα的結(jié)合作用和COX-2的表達(P<0.05).2.84mmol·L-1PCF可顯著抑制ROS的釋放，抑制作用長達48h，以3h抑制作用最強(P<0.05)。 結(jié)論：