Src激酶調(diào)控Nrf2出核轉(zhuǎn)運(yùn)在內(nèi)毒素血癥小鼠肝肺損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、背景和目的:
　　內(nèi)毒素血癥是感染導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)，是感染及重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive CareUnit，ICU)患者死亡的主要原因之一。盡管近年來醫(yī)學(xué)發(fā)展的突飛猛進(jìn)，然而內(nèi)毒素血癥的死亡率仍然居高不下，高達(dá)30％-60％。肝臟和肺臟是內(nèi)毒素血癥中較易受損的兩個器官，而內(nèi)毒素血癥肝肺損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前缺乏有效的治療措施。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid-2-related fact

2、or2，Nrf2)是內(nèi)源性抗損傷系統(tǒng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在肝肺組織抗損傷中具有重要作用。酪氨酸激酶Src是Nrf2信號通路上游具有調(diào)控Nrf2出核轉(zhuǎn)運(yùn)作用的重要激酶，在內(nèi)毒素血癥肝肺損傷中也同樣具有重要作用。我們團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)高濃度腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonarymicrovascular

3、 endothelial cells，PMVECs) Nrf2轉(zhuǎn)錄活性降低。因此在前期研究的基礎(chǔ)上推測:Src激酶催化Nrf2第568位酪氨酸發(fā)生磷酸化，繼而導(dǎo)致Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)出核降解，最終使內(nèi)源性抗損傷能力降低是內(nèi)毒素肝肺損傷發(fā)生的另一重要機(jī)制。本研究擬通過LPS誘導(dǎo)的肝肺損傷模型和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究Src激酶調(diào)控Nrf2的出核轉(zhuǎn)運(yùn)在內(nèi)毒素血癥肝肺損傷中的作用，為從內(nèi)源性抗損傷途徑干預(yù)內(nèi)毒素血癥肝肺損傷提供新思路和治療靶點(diǎn)。
　　方

4、法:
　　1抑制Src激酶對內(nèi)毒素血癥小鼠肝肺損傷的影響
　　1.1采用經(jīng)腹腔注射LPS的方式構(gòu)建小鼠內(nèi)毒素血癥肝肺損傷的模型，注射LPS后2小時經(jīng)腹腔給予Src激酶抑制劑PP2。
　　1.2取小鼠肝肺組織切片進(jìn)行HE染色觀察抑制Src激酶后病理學(xué)變化。
　　1.3采用試劑盒檢測小鼠肝肺組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、髓過氧

5、化物酶(myeloperoxidase，MPO)MPO的水平變化。
　　1.4采用試劑盒檢測小鼠血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的水平變化。
　　1.5采用western blot檢測小鼠肝肺組織Nrf2的表達(dá)變化。
　　2 Nrf2出核轉(zhuǎn)運(yùn)在LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞損傷中的作用研究
　　2.1采用免疫熒光檢測LPS刺激下Nrf2在A549細(xì)胞中的分布變化。
　　2.2采用免

6、疫熒光檢測給予Src激酶抑制劑PP2和出核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CRM1抑制劑來普霉素B(leptomycin B，LMB)后LPS誘導(dǎo)Nrf2的分布變化情況。
　　2.3采用免疫熒光檢測LPS對Nrf2+/+，Nrf2Y568A腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Nrf2分布的影響。
　　2.4采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測LPS刺激后正常細(xì)胞、給予PP2和LMB的細(xì)胞、Nrf2+/+和Nrf2Y568A腺

7、病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活性。
　　結(jié)果:
　　1.Src激酶抑制劑PP2使內(nèi)毒素血癥小鼠肺肝組織SOD、Nrf2水平明顯升高，MPO、MDA水平和血清ALP水平顯著降低，肝肺損傷程度明顯減輕。
　　2.PP2、LMB能夠阻斷LPS誘導(dǎo)的Nrf2出核轉(zhuǎn)運(yùn)，Nrf2上第568位酪氨酸突變后Nrf2不能轉(zhuǎn)運(yùn)出核。
　　3.PP2、LMB、Nrf2Y568A腺病毒轉(zhuǎn)染能顯著提高LPS刺激后的細(xì)胞活性。
　　結(jié)論: