肺癌細(xì)胞系KRAS突變檢測(cè)及聯(lián)合通路抑制劑的生長(zhǎng)抑制作用.pdf

1、自2010年以來(lái)，肺癌的靶向治療取得了很大進(jìn)展，出現(xiàn)了許多針對(duì)EGFR，MET，HER2，VEGF和ALK等靶點(diǎn)的小分子藥物，尤其是針對(duì)EGFR的靶向藥物在臨床上顯示了很好的療效。但是仍有一部分患者耐藥，難以從EGFR的靶向治療中獲益[1]。這部分患者，細(xì)查原因，大部分是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞中存在KRAS突變[2]，但往往還有其他基因如PIK3CA和PTEN等基因的突變[3-5]。這些耐藥的患者的治療也成為了臨床上的難點(diǎn)，本課題即致力于這一方面

2、的研究。
　　 自80年代在人類(lèi)腫瘤中檢出突變KRAS以來(lái)，因其與人類(lèi)腫瘤的密切關(guān)系而備受關(guān)注，關(guān)于它的文獻(xiàn)數(shù)以萬(wàn)計(jì)。大部分以臨床腫瘤標(biāo)本為研究對(duì)象，也有以多種KRAS突變腫瘤細(xì)胞系為基礎(chǔ)進(jìn)行研究的。為探討KRAS突變患者能否從小分子靶向治療藥物中獲益，我們選用KRAS突變肺癌的腫瘤細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了明確細(xì)胞資源中心所保藏的腫瘤細(xì)胞系中KRAS及相關(guān)的BRAF，EGFR，PIK3CA基因的突變情況，我們使用高分辨率溶解曲線技

3、術(shù)(HRM)對(duì)庫(kù)藏人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行突變的檢測(cè)。
　　 首先，我們提取了173種腫瘤細(xì)胞的總DNA，根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因突變的熱點(diǎn)所在的6個(gè)DNA片段，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得高拷貝數(shù)的目標(biāo)序列。然后進(jìn)行高分辨率熔解。在時(shí)間和熒光的曲線上區(qū)分出野生型，突變雜合型和突變純合型的細(xì)胞系。篩查結(jié)果顯示在腫瘤細(xì)胞系中KRAS突變?cè)谒Y查的4個(gè)基因中最為常見(jiàn)，其中胰腺癌細(xì)胞系突變率為66.67％，結(jié)直

4、腸癌細(xì)胞系為52.94％，肺癌細(xì)胞系為21.25％，是突變率最高的三種腫瘤細(xì)胞系，與文獻(xiàn)報(bào)道的臨床腫瘤患者中KRAS的突變頻率相當(dāng):胰腺癌＞80％，結(jié)直腸癌≈50％，肺癌10-30％[6] PIK3CA、BRAF、EGFR基因的突變?cè)谀[瘤細(xì)胞系中突變頻率分別為14.45％、6.35％和4.62％。另外，我們還檢測(cè)到了COC1、A875、SF767、TE671及PANC-1細(xì)胞系中的一些未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)的基因突變情況。
　　 篩查結(jié)果明確

5、了KRAS及相關(guān)基因在人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系中的突變情況，為開(kāi)展腫瘤的靶向治療研究提供了很好的模型。同時(shí)證明HRM技術(shù)是一種低成本，靈敏，特異和高通量的實(shí)驗(yàn)手段。
　　 根據(jù)前述突變檢測(cè)結(jié)果，選擇我們KRAS單突變的A549和KRAS/PTEN雙突變的NCI-H157兩株NSCLC細(xì)胞，觀察兩種信號(hào)通路抑制劑GDC-0941（PI3K/AKT/mTOR通路，PI3K抑制劑）和AZD6244（KRAS/RAF/MEK通路，MEK抑制劑）對(duì)

6、不同突變的NSCLC細(xì)胞的用藥效果。分別用不同濃度的GDC-0941和AZD6244單獨(dú)或聯(lián)合作用，MTT法初步觀察對(duì)細(xì)胞增殖的影響。根據(jù)觀察結(jié)果確定聯(lián)合給藥的濃度。設(shè)立無(wú)藥對(duì)照組、PI3K單獨(dú)抑制組(GDC-0941，0.5/5.0μmol/L)、聯(lián)合Ⅰ組(0.5μ mol/L AZD6244+0.5μ mol/L GDC-0941)及聯(lián)合Ⅱ組(5.0μ mol/L AZD6244+5.0μ mol/L GDC-0941)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)不

7、同組合濃度的抑制劑作用后，MTT法繪制增殖抑制曲線;平板集落形成法檢測(cè)集落形成能力的改變;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及周期分布;Western blot檢測(cè)不同組中抑制劑靶點(diǎn)下游周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的差異。
　　 在兩株NSCLC細(xì)胞中，單獨(dú)抑制RAS/RAF/MEK通路或PI3K/AKT/mTOR通路效果較差。抑制劑AZD6244或GDC-0941作用于A549細(xì)胞的抑制率分別可達(dá)25.5％和38.1％，作用于NCI-H157

8、細(xì)胞的抑制率分別可達(dá)16.9％和35.1％。Westernblot結(jié)果顯示AZD6244抑制RAS/RAF/MEK通路后（降低pERK活化）激活PI3K/AKT/mTOR通路（增強(qiáng)pAKT活化）。相反，GDC-0941抑制PI3K/AKT/mTOR通路后激活了RAS/RAF/MEK通路。結(jié)果表明單通路突變的細(xì)胞，僅抑制該突變通路，效果差。未突變通路的抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖也有抑制作用。無(wú)論肺癌細(xì)胞是KRAS單突變，還是KRAS/PTEN

9、雙突變，單通路抑制效果較差，需要雙通路聯(lián)合抑制提高療效。
　　 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR雙通路聯(lián)合抑制可增強(qiáng)KRAS/PTEN雙突變的NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。在NCI-H157細(xì)胞中，低劑量的聯(lián)合Ⅰ組表現(xiàn)為兩藥協(xié)同作用（q值=1.22），高劑量的聯(lián)合Ⅱ組表現(xiàn)為兩藥相加作用（q值=0.92）;集落形成能力下降[77.2±1.54個(gè)/孔VS61.5±2.12個(gè)/孔，P＜0.01]和[51±4個(gè)/孔VS

10、22.5±3.53個(gè)/孔，P＜0.01];凋亡率增加[18.3±0.82％ VS21.32±0.56％，P＜0.01]和[27.14±1.58％ VS42.45±4.42％，P＜0.01];細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，聯(lián)合抑制組G0/G1期細(xì)胞增加，S期明顯減少(P＜0.01)。Western blot顯示，聯(lián)合抑制組與PI3K單獨(dú)抑制組相比，CyclinD1，CyclinB1表達(dá)量減少，P21表達(dá)量和PARP剪切增加，Bcl-2/Bax的比

11、值下降。表明雙通路聯(lián)合抑制，可降低劑量，增強(qiáng)藥效。
　　 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR雙通路聯(lián)合抑制亦可增強(qiáng)KRAS單突變的NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。但是由于兩條通路的相互制衡作用，藥效受兩通路相對(duì)抑制情況的影響。在A549細(xì)胞中，聯(lián)合Ⅰ組與低劑量的PI3K單獨(dú)抑制組相比，兩抑制劑表現(xiàn)為拮抗作用(q=0.58)，對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用未見(jiàn)增強(qiáng)，反而刺激了細(xì)胞的生長(zhǎng)，集落形成能力[114.5±3.53個(gè)

12、/孔VS133±4.24個(gè)/孔，P＜0.01]，細(xì)胞周期的分布及凋亡率無(wú)明顯差異。聯(lián)合Ⅱ組與高劑量PI3K抑制組相比，兩抑制劑表現(xiàn)為相加作用(q=0.90)，細(xì)胞的增殖抑制作用出現(xiàn)了明顯增強(qiáng)，集落形成能力明顯下降[75.5±3.53個(gè)/孔VS50.5±4.94個(gè)/孔，P＜0.01];凋亡率顯著增加[37.85±3.18％ VS52.27±4.36％，P＜0.01]，細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，聯(lián)合抑制組G0/G1期細(xì)胞增加，S期明顯減少(P＜

13、0.01)。Western blot顯示，CyclinD1，CyclinB1表達(dá)量減少，PARP剪切增加，Bcl-2/Bax的比值下降。
　　 總之，RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR雙通路聯(lián)合抑制可使KRAS單突變和KRAS/PTEN雙突變的NSCLC細(xì)胞的治療獲益，尤其是在KRAS/PTEN雙突變NSCLC細(xì)胞中表現(xiàn)為協(xié)同作用。但是對(duì)于KRAS單突變NSCLC細(xì)胞，聯(lián)合抑制效果受到藥物劑量和相關(guān)信號(hào)通路中基因