Cbl-b通過EGFR-SRC-AKT信號通路調(diào)節(jié)5-FU抑制胃癌細胞增殖的機理研究.pdf

1、前言
　　胃癌在世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，目前主要的治療手段包括外科手術(shù)和化療。對于不可手術(shù)的患者，化療能夠延長生存期和提高生活質(zhì)量。然而，進展期胃癌患者的預(yù)后仍然是很不理想的。此外，細胞毒化療藥物的副作用常常導(dǎo)致進展期胃癌患者生活質(zhì)量下降。因此，為了提高臨床治療效果，需要更多有效的可耐受的治療方案。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)廣泛應(yīng)用于包括胃癌在內(nèi)的實體腫瘤的治療。但胃癌患者對5-FU的敏感性非常

2、有限。因此，有必要進一步研究5-FU作用的機制及如何提高5-FU的療效。目前已經(jīng)深入探討了在腫瘤治療方面如何提高腫瘤細胞對化療藥物誘導(dǎo)凋亡敏感性的方案，近期的研究顯示EGFR/SRC/AKT信號通路與5-FU的敏感性有關(guān)，提示調(diào)節(jié)EGFR/SRC/AKT信號通路的蛋白可能對5-FU的敏感性有一定的影響。
　　Cbl作為E3泛素連接酶發(fā)揮作用，它的RING辛指節(jié)構(gòu)募集E2連接酶，而它的Src同源區(qū)域識別被泛素化的靶蛋白。Cbl-b是

3、Cbl家族成員之一，在造血細胞大量表達，研究顯示Cbl-b能通過抑制細胞表面受體及其下游信號通路的激活而負性調(diào)節(jié)T細胞、B細胞和主細胞的活化以及白血病發(fā)生。Feng等的研究表明，PI3K的調(diào)節(jié)亞單位p85也是Cbl-b的作用底物，Cbl-b以蛋白酶解非依賴的方式負性調(diào)節(jié)p85。Cbl-b（-/-）cells存在AKT的高度活化及晚期T細胞的異常增殖。我們先前的研究表明，化療藥物如依托鉑苷、表阿霉素、柔紅霉素及三氧化二砷能上調(diào)白血病細胞C

4、bl-b的表達，Cbl-b通過抑制PI3K/AKT信號通路增加化療敏感性。我們近期的研究結(jié)果進一步證實Cbl-b提高5-FU誘導(dǎo)胃腺癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR的化療敏感性。盡管還沒有直接的證據(jù)，這些資料表明Cbl-b可能通過EGFR/SRC/AKT信號通路參與調(diào)節(jié)胃癌細胞對5-FU的敏感性。因此，綜合文獻報道，我們提出如下推測:Cbl-b通過促進EGFR、SRC和AKT等的泛素化，下調(diào)EGFR、SRC和AKT等的活化，使增殖信

5、號傳導(dǎo)減弱，從而協(xié)同5-FU抑制胃癌細胞增殖，Cbl-b可能對抑制人類腫瘤細胞包括胃癌細胞的增殖，提高化療敏感性起到關(guān)鍵的作用。
　　本研究以人胃癌細胞株MGC-803、BGC-823和SGC-7901為研究對象，進行如下研究:觀察5-FU對3種胃癌細胞系的增殖抑制作用;研究5-FU作用胃癌MGC803細胞是否存在EGFR、SRC、AKT等蛋白表達的變化，以及是否存在Cbl-b蛋白表達的變化;探討轉(zhuǎn)染Cbl-bshRNA的胃癌MG

6、C803細胞與轉(zhuǎn)染vector的細胞相比較，對5-FU的敏感性是否存在差異;明確Cbl-b是否可以通過EGFR/SRC/AKT信號通路調(diào)控5-FU抑制胃癌細胞增殖。
　　材料和方法
　　1、細胞培養(yǎng)
　　2、Cbl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞系的建立
　　3、MTT檢測增殖抑制
　　4、流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　5、免疫沉淀及免疫雜交檢測蛋白表達
　　6、統(tǒng)計學(xué)處理:每次實驗重復(fù)

7、3次，數(shù)據(jù)以Mean±S.D.表示，采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　一、5-FU對胃癌細胞增殖抑制和凋亡的影響
　?。ㄒ唬?-FU作用胃癌MGC803細胞不同時間（24h、48h和72h）可抑制細胞增殖，不同劑量5-FU作用三種胃癌細胞系（MGC803、SGC7901和BGC823）48h可不同程度抑制細胞增殖，IC50值分別是2.0±0.9μg/mL、4.5±1.1μg/

8、mL和1.3±0.8μg/mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＞0.05。
　?。ǘ?-FU（2.0μg/mL）作用不同時間(24h，48h和72h)可誘導(dǎo)MGC803細胞不同程度的凋亡，5-FU(2.0μg/mL)作用三種胃癌細胞系(MGC803、SGC7901和BGC823)48h可引起不同程度的細胞凋亡。
　?。ㄈ?-FU（2.0μg/mL）作用MGC803細胞6h可見TS三元復(fù)合物表達增多，48h表達最強，提示5-FU

9、通過與TS形成穩(wěn)定三元復(fù)合物抑制游離TS酶活性，抑制胃癌細胞增殖。
　?。ㄋ模┎煌瑵舛?2.0μg/mL，20.0μg/mL)5-FU作用MGC803細胞48h可誘導(dǎo)線粒體膜電位不同程度下降，提示5-FU通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位誘導(dǎo)MGC803細胞凋亡。
　?。ㄎ澹?-FU（2.0μg/mL）作用MGC803細胞48h可明顯抑制Bcl-2蛋白表達，對BAX蛋白表達無顯著影響，Bcl-2/BAX比值明顯下調(diào)，提示5-FU可通過調(diào)節(jié)

10、Bcl-2/BAX比值誘導(dǎo)MGC803細胞凋亡。
　　二、5-FU作用MGC803細胞增殖信號通路蛋白的表達
　?。ㄒ唬?-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可見磷酸化EGFR表達增強，在5-FU作用6h達峰值，在5-FU作用24h磷酸化EGFR表達逐漸下降。
　?。ǘ?-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可見磷酸化SRC表達增強，在5-FU作用6h達峰值，在5-FU作用24h磷酸化SRC表達逐漸

11、下降。
　?。ㄈ?-FU（2.0μg/mL）作用MGC8031h可見磷酸化AKT表達增強，在5-FU作用6h達峰值，在5-FU作用24h磷酸化AKT表達下降。
　?。ㄋ模?-FU(2.0μg/mL)作用MGC8031h可見磷酸化ERK表達下降，在5-FU作用24h表達增強，在5-FU作用48h表達最強。
　?。ㄎ澹㎝EK/ERK通路抑制劑PD98059(20μM)作用MGC803細胞24h及48h，可明顯抑制5-FU

12、誘導(dǎo)的ERK活化。
　?。㏄D98059(20μM)及LY294002(25μM)可明顯增加5-FU誘導(dǎo)MGC803細胞凋亡(25.42±4.0％，40.63±3.5％)（p值分別為0.011和0.001）。
　　三、Cbl調(diào)節(jié)5-FU活性機制的研究
　?。ㄒ唬┟庖叱恋砑懊庖哂∮浗Y(jié)果顯示，5-FU（2.0μg/mL）作用MGC803細胞24hCbl-b活化增強，持續(xù)至48h，提示Cbl-b可能參與調(diào)節(jié)5-FU抑制胃

13、癌細胞增殖。
　?。ǘ┙bl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞，westernblot結(jié)果顯示，與Vector組比較，Cbl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞無Cbl-b蛋白表達。MTT檢測結(jié)果顯示，與Vector組比較，Cbl-bshRNA組細胞增殖活性增強，48h的IC50值分別為10.67±5.0μg/mL和1.57±0.7μg/mL(p=0.001)。
　?。ㄈ┝魇郊毎麅x檢測結(jié)果顯示，5-FU

14、(2.0μg/mL)作用48hCbl-bshRNA組與Vector組的凋亡百分率分別為18±3.0和32±4.0(p=0.001)。提示Cbl-bshRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細胞對5-FU的敏感性下降。
　?。ㄋ模?-FU(2.0μg/mL)作用48h，Cbl-bshRNA組與Vector組的跨膜電位下降百分率分別為18±4.3和30±6.2，p=0.001;5-FU作用72h，Cbl-bshRNA組與Vector組的跨膜電

15、位下降率分別為和37±5.6和63±7.4，p=0.001。結(jié)果提示Cbl-b通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位下降誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。
　?。ㄎ澹￤esternblot結(jié)果顯示，5-FU(2.0μg/mL)作用48h，與Vector組比較，Cbl-bshRNA組Bcl-2表達上調(diào)，Bcl-2/BAX比值上調(diào)，提示Cbl-bshRNA組通過上調(diào)Bcl-2/BAX比值減少胃癌細胞凋亡，即Cbl-b通過下調(diào)Bcl-2/BAX比值誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。

16、r>　?。￤esternblot結(jié)果顯示，在5-FU(2.0μg/mL)作用下，與vector組比較，Cbl-bshRNA組EGFR、SRC及AKT的活化時間延長，對ERK的活化無明顯影響，對TS的表達也無明顯影響。提示Cbl-bshRNA組可能通過活化EGFR/SRC/AKT通路減少胃癌細胞凋亡，也就是說，Cbl-b可能通過下調(diào)EGFR/SRC/AKT通路的活化增加胃癌細胞對5-FU的敏感性。
　?。ㄆ撸￤esternblo

17、t結(jié)果顯示，與vector組比較，5-FU(2.0μg/mL)作用Cbl-bshRNA組TS蛋白表達無明顯差異，提示Cbl-b可能不是通過調(diào)節(jié)TS蛋白表達影響胃癌細胞對5-FU的敏感性。
　　結(jié)論
　　1、5-FU以時間劑量依賴的方式抑制胃癌細胞增殖，誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。
　　2、EGFR/SRC/AKT信號通路參與5-FU抑制胃癌細胞增殖。
　　3、Cbl-b通過調(diào)節(jié)EGFR/SRC/AKT信號通路參與調(diào)控5-F