PinX1抑制胃癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)其對(duì)5-FU敏感性及機(jī)制研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文PinX1抑制胃癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)其對(duì)5FU敏感性及機(jī)制研究姓名：王洪斌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（消化系?。┲笇?dǎo)教師：房殿春20090501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文態(tài)特征的變化。5、通過MTT法觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖能力的變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。6通過MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后胃癌MKN28細(xì)胞對(duì)化療藥物5一FU的敏感性變化。7通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變。8通過半定量RTPCR及westemBlot

2、ting檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各細(xì)胞系中Madl／c—Myc水平的改變。9、采用熒光素標(biāo)記的端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后各細(xì)胞系端粒酶活性的變化。結(jié)果：1經(jīng)酶切及測(cè)序證明，成功構(gòu)建重組PinXl真核表達(dá)載體及針對(duì)PinXl編碼區(qū)的的RNA干涉真核表達(dá)載體與陰性對(duì)照載體；2、檢測(cè)表明：高分化的Ml(N28細(xì)胞中無PinXl表達(dá)，低分化的BGC823細(xì)胞PinXl高表達(dá)，中分化的SGC7901細(xì)胞Pinxl中等表達(dá)；3成功地將構(gòu)建好

3、的重組真核表達(dá)載體及干涉載體通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染胃癌MKN28與BGC823細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株；檢測(cè)表明，PinXl基因成功地轉(zhuǎn)染入MKN28細(xì)胞；有2條干擾序列對(duì)PinXl有干擾效果；4細(xì)胞形態(tài)特征：HE染色可見轉(zhuǎn)染PinXl基因的Ml(N28細(xì)胞為多邊形，但是大小不一更為明顯，大而扁平的細(xì)胞更為常見，巨細(xì)胞比例明顯增加，最大的細(xì)胞體積可以達(dá)到小細(xì)胞的5～lO倍，多核細(xì)胞常見；未轉(zhuǎn)染的MKN28細(xì)胞呈梭形、短梭

4、形，大小不一。透射電鏡特征：轉(zhuǎn)染PinXl基因的Ml(N28細(xì)胞內(nèi)可見凋亡小體，小體內(nèi)可見半月形異染色質(zhì)；而未轉(zhuǎn)染或僅轉(zhuǎn)染空載體的胃癌MKN28細(xì)胞內(nèi)可見細(xì)胞器減少，幼稚，線粒體呈桿狀，核漿比例增大，核仁突出；5MTT檢測(cè)表明：轉(zhuǎn)染PinXl基因的Ml(N28細(xì)胞較之未轉(zhuǎn)染或僅轉(zhuǎn)染空載體的胃癌MKN28細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢(PO05)：6MTT檢測(cè)表明：轉(zhuǎn)染Pinxl基因的MKN28細(xì)胞對(duì)5一FU的半數(shù)抑制濃度(IC50)值為O253O02

5、1mg／L，明顯低于未轉(zhuǎn)染或僅轉(zhuǎn)染空載體的胃癌MKN28細(xì)胞的IC50值(分別為0560O017及O590O026mg／L)(PO05)；7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡表明：轉(zhuǎn)染Pinxl基因的MKN28細(xì)胞的Go／G1期細(xì)胞數(shù)(％)為8476392，明顯高于未轉(zhuǎn)染或僅轉(zhuǎn)染空載體的胃癌MKN28細(xì)胞的Go／Gl期細(xì)胞數(shù)(分別為6874696及65913OO)(PO05)；而轉(zhuǎn)染PinXl基因的Ml喇28細(xì)胞的增殖指數(shù)(％)為1524